缺血性中風(fēng)（Ischemic Stroke）作為一種常見的腦血管疾病，是我國成年人致殘的首要原因。到目前為止，還缺乏促進(jìn)中風(fēng)康復(fù)和改善長期預(yù)后的治療藥物。中風(fēng)后，缺血邊緣區(qū)的血管修復(fù)可以通過改善血液供應(yīng)、重構(gòu)血管周圍微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生及突出形成等多方面促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，被廣泛認(rèn)為是改善缺血性中風(fēng)預(yù)后的關(guān)鍵修復(fù)措施。故研究中風(fēng)后的血管修復(fù)的機(jī)制及治療策略是一個迫切的研究領(lǐng)域，可以使大量患者受益。

環(huán)狀RNA (circRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼RNA分子，具有反向拼接和共價閉合連續(xù)環(huán)形成的圓形結(jié)構(gòu)。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外囊泡(EV)穿過血腦屏障(BBB)并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。而有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA已被證明可以通過增強(qiáng)神經(jīng)可塑性、抑制神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性和外周免疫細(xì)胞浸潤來改善中風(fēng)后的運(yùn)動功能恢復(fù)[1]。然而，circRNA是否促進(jìn)缺血性中風(fēng)后血管修復(fù)及其下游機(jī)制尚不清楚。

2023年1月，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院姚紅紅教授課題組在Nature子刊Nature Communications（IF=17.694）?發(fā)表文章FTO-dependent m6A modification of Plpp3?in circSCMH1-regulated vascular repair and functional recovery following stroke。作者發(fā)現(xiàn)EV-circSCMH1能夠有效促進(jìn)缺血性中風(fēng)模型小鼠與恒河獼猴腦血管修復(fù)，并且顯著降低中風(fēng)模型小鼠腦部N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾。機(jī)制上，circSCMH1促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞FTO發(fā)生泛素化修飾，增加FTO向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致血管發(fā)育相關(guān)基因-脂質(zhì)磷酸磷酸酶3（lipid phosphate phosphatase 3，Plpp3）的m6A修飾降低，從而抑制了YTHDF2對Plpp3 mRNA的降解，導(dǎo)致Plpp3 mRNA與其編碼蛋白LPP3在內(nèi)皮細(xì)胞中的水平增加，促進(jìn)血管修復(fù)。本研究從血管修復(fù)層面擴(kuò)展了circSCMH1促進(jìn)缺血性中風(fēng)腦修復(fù)的機(jī)制，為治療缺血性中風(fēng)的新藥研發(fā)提供了新思路和新靶點。

1、circSCHM1改善缺血性中風(fēng)恢復(fù)期的血管修復(fù)

circSCMH1已被報道在中風(fēng)后可顯著增強(qiáng)神經(jīng)元可塑性和功能恢復(fù)。作者為了研究circSCMH1在缺血性中風(fēng)時血管修復(fù)中的潛在參與，通過EVs將circSCMH1傳遞到血栓形成(PT)的恒河獼猴的大腦。結(jié)果顯示，circSCMH1可顯著增加血管面積、長度及分支數(shù)量，增加BrdU陽性細(xì)胞以及與血管修復(fù)相關(guān)的內(nèi)皮和周圍細(xì)胞；小鼠模型結(jié)果與之一致?？傊黜椫笜?biāo)均表明，EV-circSCMH1可增加PT模型小鼠梗死周圍區(qū)域circSCMH1水平，并促進(jìn)血管修復(fù)。而針對于中風(fēng)模型的血腦屏障完整性的重建，circSCMH1也有著積極的影響。

2、m6A修飾在中風(fēng)患者和PT小鼠增加

m6A甲基化參與血管修復(fù)已被很多人報道[2]。作者收集了中風(fēng)患者和非中風(fēng)的體感覺皮層組織，發(fā)現(xiàn)中風(fēng)患者組織中m6A甲基化水平顯著升高，circSCMH1水平較低。作者檢測了m6A相關(guān)甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中風(fēng)患者組織中FTO水平明顯降低，其余基因無明顯差異；同樣，在小鼠模型上的驗證結(jié)果與之一致。

3、circSCMH1與FTO結(jié)合可減少m6 A修飾

前兩部分結(jié)果指向：（1）circSCMH1增強(qiáng)中風(fēng)后血管修復(fù)；（2）在中風(fēng)和非中風(fēng)患者中，circSCMH1與m6A水平之間存在負(fù)相關(guān)。接下來，作者解析了circSCMH1對中風(fēng)后m6A甲基化影響的機(jī)制。EV-circSCMH1作用小鼠大腦后，PT模型誘導(dǎo)后梗死周圍區(qū)域總RNA的m6A水平顯著降低，而敲低circSCMH1的結(jié)果與之相反。

作者研究了circSCMH1對FTO表達(dá)的影響。然而，WB結(jié)果顯示在中風(fēng)模型中，EV-circSCMH1組和EV-Vector組的FTO水平無顯著差異。這提示，circSCMH1可減弱m6A水平，但不影響中風(fēng)后FTO水平。

先前的研究表明，F(xiàn)TO在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出不同的底物偏好，m6A更可能是細(xì)胞核中初級聚腺苷酸RNA中的FTO底物29。因此，作者將眼光放到circSCMH1是否影響FTO轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。我們首先研究了circSCMH1和FTO之間的相互作用。

通過RNA結(jié)合免疫沉淀試驗，與陰性對照circHECW2和GAPDH相比，circSCMH1，而不是SCMH1，在ECs中顯示出與FTO更強(qiáng)的親和力。circSCMH1 pulldown實驗顯示，circSCMH1比circCon富集更多的FTO。作者進(jìn)一步利用catRAPID算法預(yù)測出FTO中的三個區(qū)域與circSCMH1具有較高的互作能力，并設(shè)計突變和野生型載體進(jìn)行了驗證。綜上提示，ECs中circSCMH1和FTO之間存在互作，并減少了m6 A修飾。

4、circSCMH1通過泛素化增加了FTO進(jìn)入細(xì)胞核的易位

由于circSCMH1不影響PT小鼠FTO的水平，促使作者進(jìn)一步檢查FTO的核質(zhì)再分配。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EV-circSCMH1給藥后，PT小鼠FTO水平在細(xì)胞質(zhì)中降低，而在細(xì)胞核中增加。這一發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性小鼠大腦微血管ECs和bEnd.3細(xì)胞中得到證實。

有研究報道，泛素化可促進(jìn)FTO從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，作者接下來研究了circSCMH1對FTO泛素化的潛在影響。circSCMH1過表達(dá)顯著增加了賴氨酸63（Ub-K63）連接的泛素化水平。UBC13是Ub-K63的E2泛素偶聯(lián)酶。RNA結(jié)合免疫沉淀實驗顯示，circSCMH1在bEnd中對UBC13具有更強(qiáng)的親和力。

由于circRNAs被證明可以作為一個支架來增強(qiáng)泛素酶與其靶基因的結(jié)合[32]，接下來作者研究circSCMH1是否可以增強(qiáng)FTO與UBC13的結(jié)合。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，circSCMH1能夠促進(jìn)FTO和UBC13相互作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)，UBC13的敲低顯著減弱了circSCMH1增強(qiáng)的FTO向細(xì)胞核的易位，為此作者做了調(diào)控模型如圖k所示。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circSCMH1通過UBC13酶增加FTO的Ub-K63，并促進(jìn)FTO從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。

5、circSCMH1調(diào)控PT小鼠梗死周圍皮層Plpp3 mRNA的m6A修飾

circSCMH1已被驗證可降低PT中風(fēng)模型中m6A甲基化水平，作者接下來探索下游甲基化基因?；鹕椒植紙D顯示，PT模型誘導(dǎo)后，m6A水平在279個轉(zhuǎn)錄本峰值區(qū)域顯著升高，在898個轉(zhuǎn)錄本峰值區(qū)域顯著降低，EV- circSCMH1轉(zhuǎn)錄本顯著增加213個峰區(qū)，減少499個峰區(qū)。使用HOMER算法在EV-circSCMH1和EV-Vector治療后的PT小鼠中鑒定出高度過度代表的共識序列GGACU motif，這表明PT模型m6A修飾的mRNA成功富集。

通過分析m6A峰的密度，我們發(fā)現(xiàn)在PT中風(fēng)誘導(dǎo)后，m6A修飾水平在梗死周圍區(qū)增加，EV-circSCMH1處理抑制了PT誘導(dǎo)的m6A修飾。PT模型誘導(dǎo)后，14個轉(zhuǎn)錄本的m6A峰值顯著增加，EV-circSCMH1處理后抑制這14個轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)。兩組比較中有8個重疊的轉(zhuǎn)錄本，這提示circSCMH1影響了PT后血管修復(fù)的靶轉(zhuǎn)錄本。

m6A通常在3-UTR中富集，作者進(jìn)一步研究了m6A甲基化的變化是否影響這8種重疊轉(zhuǎn)錄本的水平。通過qPCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)，EV-circSCMH1上調(diào)血管生成相關(guān)基因Plpp3的表達(dá)。進(jìn)一步分析了Plpp3的m6A修飾水平，結(jié)果顯示，EV-circSCMH1減弱了Plpp3的m6 A修飾水平，而敲低FTO則可逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。這表明m6A修飾介導(dǎo)了circSCMH1增強(qiáng)了Plpp3 mRNA的穩(wěn)定性。

6、FTO過表達(dá)促進(jìn)PT小鼠血管及運(yùn)動功能的恢復(fù)

FTO位于circSCMH1的下游。FTO過表達(dá)上調(diào)PT中風(fēng)后Plpp3/LPP3的表達(dá)及其m6A甲基化，增加血管長度和分支數(shù)，增加BrdU+細(xì)胞數(shù)，腳部故障減少。這表明，在PT中風(fēng)后，F(xiàn)TO會促進(jìn)血管和運(yùn)動功能的恢復(fù)。后續(xù)作者又使用了AAV載體構(gòu)建，結(jié)果與此一致，腦中風(fēng)后FTO的特異性表達(dá)有助于血管和運(yùn)動功能的修復(fù)。

小結(jié)

綜上所述：作者在恒河猴和小鼠上構(gòu)建中風(fēng)模型，發(fā)現(xiàn)circSCMH1顯著促進(jìn)中風(fēng)后的血管修復(fù)。具體機(jī)制在于，circSCMH1促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞FTO發(fā)生泛素化修飾，增加FTO向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Plpp3的m6A修飾降低，從而抑制了YTHDF2對Plpp3 mRNA的降解，導(dǎo)致Plpp3 mRNA與其編碼蛋白LPP3的水平增加，促進(jìn)血管修復(fù)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36008-y

參考文獻(xiàn)：

[1]?Yang, L. et al. Extracellular vesicle-mediated delivery of circular?RNASCMH1 promotes functional recovery in rodent and nonhuman?primate ischemic stroke models. Circulation 142, 556–574 (2020).

[2]?Yao, M. D. et al. Role of METTL3-dependent N(6)-methyladenosine?mRNA modification in the promotion of angiogenesis. Mol. Ther.28,2191–2202 (2020).

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