1.????實驗目的

使用抗原免疫后羊駝PBMC構建噬菌體文庫

2.????實驗設計

從羊駝PBMC中提取總RNA，反轉錄為cDNA，經過兩輪PCR擴增后得到抗體序列擴增產物，選擇載體進行酶切后連接，最后轉化至SS320大腸桿菌感受態(tài)細胞得到細菌文庫，經過輔助噬箘體（M13KO7）侵染并誘導后制備獲得噬菌體文庫。

3.????實驗方法與步驟

3.1總RNA提取

3.1.1將羊駝PBMC樣品從-80℃冰箱中取出，分裝0.5ml/管，每管中加入100μl氯仿，在震蕩器上劇烈震蕩15s后，室溫放置靜置5min；

3.1.2將離心機預冷至4℃，12000g離心15min，離心后出現分層，將最上層的透明層用移液槍小心轉移到新的無RNase和DNase的1.5ml離心管中，每管加入250μl的異丙醇，上下顛倒多次混勻后室溫放置靜置10min；

3.1.3 12000g離心10min，去除上清保留沉淀；

3.1.4每管加入1ml 75%乙醇，上下顛倒多次以懸浮沉淀；

3.1.57500g離心5min，去除上清保留沉淀；

3.1.6保持離心管口打開，室溫放置干燥10min，每管加入DEPC處理水溶解，55℃孵育10min以確保RNA完全溶解；

3.1.7小心吸取至同一個離心管中，即為PBMC中提取出的總RNA；

3.1.8取1μl上述總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測總RNA的完整性，同時取2μl用核酸濃度測量儀檢測RNA的濃度和A260/A280并記錄。

3.2?RNA反轉錄

樣品在總RNA提取后立即使用反轉錄試劑盒進行反轉錄以減少RNA的降解。

3.2.1將上述總RNA樣品分為兩份，一份使用試劑盒內的Oligo dT Primer作為引物，另一份用試劑盒內的Random 6-mers作為引物，在1.5ml離心管中按下表比例配置反應液，當總RNA量大于5μg時，同比例擴大反應體系。

3.2.2將含有上述反應液的離心管放入金屬加熱器中，65℃反應5min使RNA變性，反應結束后置于冰上迅速冷卻；

3.2.3在上述1.5ml離心管中按下表比例配置反應液，當管內總體積大于10μl時，同比例擴大反應體系。

3.2.4緩慢混勻后，將含有上述反應液的離心管放入金屬加熱器中，45℃反應60min，再75℃反應15min，冰上冷卻，即為總RNA反轉錄后的cDNA，-20℃保存。

3.3 PCR擴增

3.3.1第一輪PCR

6.3.1.1以cDNA為模板進行第一輪PCR反應，為了確定最佳模板使用量，分別使用0.5μl，1μl，2μl，3μl，4μl，5μl的oligo dT Primer和random 6-mer的cDNA作為模板，按照下表配置PCR反應體系：

按照下表配置并進行PCR反應：

3.3.1.2反應結束后，取20μl PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，最終選取電泳結果中目的條帶單一且片段大小為600bp的模板量為最佳模板量，將所有cDNA按照此模板量并使用3.3.1.1相同條件進行PCR反應；

3.3.1.3將所有PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收目的片段大小在600bp左右的條帶；

3.3.1.4使用通用型DNA純化回收試劑盒對切膠的膠條進行DNA回收，根據試劑盒說明書，按照下述步驟進行：

（1）柱平衡：向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL，12000 rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

（2）將從瓊脂糖凝膠中切下的DNA條帶放入干凈的離心管中，稱取重量；

（3）向膠塊中加入等體積PC溶液（如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlPC溶液），50℃水浴放置10 min左右，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解；

（4）將上一步所得溶液加入平衡過的放入收集管中的吸附柱CB2中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中；

（5）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中；

（6）重復操作步驟（5）；

（7）將吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置2min，徹底晾干；

（8）將吸附柱CB2放入一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30μl的ddH2O，室溫放置2min。12000 rpm離心2 min，收集DNA溶液；

（9）??????將所有純化回收產物收集至一個離心管中，即為第一輪PCR擴增產物，-20℃保存。

3.3.2第二輪PCR

3.3.2.1將第一輪PCR擴增產物作為模板進行第二輪PCR反應，為了確定最佳模板使用量，分別使用0.1μl，0.2μl，0.3μl，0.5μl，1.0μl，2.0μl作為模板，按照下表配置PCR反應體系：

按照下表配置并進行PCR反應：

3.3.2.2反應結束后，取20μl PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，最終選取電泳結果中目的條帶單一且片段大小為600bp的模板量為最佳模板量，將已獲得的第一輪PCR擴增產物的1/20體積共576個反應按照此模板量并使用3.3.2.1相同條件進行PCR反應；

3.3.2.3使用通用型DNA純化回收試劑盒對PCR反應液進行DNA純化，根據試劑盒說明書，按照下述步驟進行：

（1）柱平衡：向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

（2）根據PCR反應液的體積，向其中加入等倍體積PC溶液，充分混勻；

（3）將上一步所得溶液加入一個放入收集管中的吸附柱CB2中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

（4）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前請先確認已加入無水乙醇），12000rpm離心1分min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中；

（5）重復操作步驟（4）；

（6）將吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置2min，徹底晾干；

（7）將吸附柱CB2放入一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30μl的ddH2O，室溫放置2min，12000 rpm離心2 min，收集DNA溶液。

（8）將回收回的所有產到物收集至一個離心管中，即為第二輪PCR擴增產物，同時取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產物的濃度并記錄，其余產物-20℃保存。

3.4載體與PCR產物酶切連接

3.4.1酶切體系分別如下表。

載體酶切體系：

第二輪PCR擴增產物酶切體系：

3.4.2 37℃孵育2h，分別補加10μl和2μl限制性內切酶Bgl 1至載體和PCR擴增產物反應中，繼續(xù)酶切2h；

3.4.3酶切結束后，使用通用型DNA純化回收試劑盒純化載體和酶切產物，純化步驟同3.3.2.3；

3.4.4酶切反應純化后，分別取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產物的濃度，然后按照下表配制連接反應體系：

3.4.5將上述連接反應4℃過夜（約16h）孵育；

3.4.6酶切結束后，使用通用型DNA純化回收試劑盒純化連接反應液，純化步驟同3.3.2.3，取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產物的濃度并記錄，4℃保存。

3.5細菌文庫構建

將連接產物進行電擊轉化后構建含有納米抗體片段的大腸桿菌文庫。

3.5.1取100ng回收連接產物，按照以下步驟進行電擊轉化：

3.5.1.1從-80℃超低溫保存箱取出1管SS320大腸桿菌感受態(tài)細胞，冰上放置5min使其融化；

3.5.1.2使用提前預冷的槍頭加入100ng連接產物，輕輕吹勻，轉移到已經預冷的1mm電轉杯中，輕敲電轉杯，讓混合物流至電轉杯底部；

3.5.1.3設定1800V，1mm間距，進行電轉，完成后立即加入950μl 37℃預溫的SOC培養(yǎng)基，將菌液從電轉杯中快速取出至1.5ml離心管中，37℃，200rpm震蕩復蘇1h；

3.5.2復蘇后的菌液按使用2×YT液體培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋，共稀釋6個梯度，即將復蘇后的菌液取100μl稀釋到1000μl，再從中取100μl稀釋到1000μl，依次類推，共稀釋10，100，1000，10000，100000，1000000倍；

3.5.3從10倍梯度稀釋中每管取100μl均勻涂布到2×YT固體培養(yǎng)基（Amp），37℃靜置培養(yǎng)過夜；

3.5.4數出梯度稀釋平板上的菌落數目，并使用公式計算連接效率：

3.5.5同時隨機挑選平板上的48個單克隆菌，接種于含有氨芐抗性的1ml 2×YT液體培養(yǎng)基（Amp）的離心管中，37℃培養(yǎng)3h，按照下表配制PCR反應并進行單菌落PCR：

PCR反應體系：

PCR反應條件：

3.5.6將單菌落PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶片段大小為600bp的菌落認定為陽性克隆，按公式計算連接產物陽性克隆率：

3.5.7按照3.5.1相同方法進行20個電擊轉化反應，將復蘇后的全部菌液集中至一個15ml搖菌管中混勻，取100μl復蘇菌液按照3.5.2-3.5.6方法計算連接效率和陽性克隆率，其余復蘇菌液則均勻涂布到5個含有100μg/ml Amp和2%葡萄糖的2%瓊脂糖的245mm方形培養(yǎng)基平板中，37℃正置過夜培養(yǎng)；

3.5.8取過夜培養(yǎng)的方形板，在每個培養(yǎng)板表面加6ml 2×YT液體培養(yǎng)基，用涂布棒輕輕將5個方形板菌落刮下并將菌液收集至同一個50ml離心管中，加入終濃度為20%的甘油，即為細菌文庫。陽性克隆率為按照3.5.6方法計算出的陽性克隆率，庫容量按照公式計算；

3.5.9取20μl上述細菌液到980μl 2×YT液體培養(yǎng)基中并使用分光光度計測量OD600，根據以下公式計算記錄細菌文庫總OD600；將細菌文庫菌液進行分裝10管，1ml/管，其余保留在50ml離心管中，-80℃保存；

3.5.10從菌落PCR檢測的陽性克隆中隨機挑選48個克隆送測序，將測序結果中納米抗體片段翻譯成氨基酸序列后進行序列比對，檢測細菌文庫中序列多樣性。

3.6噬箘體文庫構建

3.6.1噬菌體擴增

3.6.1.1從-80℃冰箱中取出細菌文庫，冰上融化，根據下面公式計算出相應菌液量，轉接到100ml含10μg/ml Tet和100μg/ml Amp的2×YT液體培養(yǎng)基中，以使初始OD600為0.1：

3.6.1.2在恒溫搖床中37℃，250rpm培養(yǎng)直至菌液OD600達到0.5-0.55；

3.6.1.3加入輔助噬菌體M13KO7以使細菌個數：噬菌體數=1：20：

3.6.1.4在恒溫搖床中37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)30 min；

3.6.1.5分別加入終濃度為50μg/mlKana和終濃度為0.2μM IPTG，恒溫搖床中30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。

3.6.2噬菌體文庫制備

3.6.2.1將過夜培養(yǎng)的菌液轉移至新的50ml離心管中4000 rpm，4 ℃離心10min；

3.6.2.2將離心后的上清液轉移至新的50ml離心管中，加入1/4體積的4℃預冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混勻后冰上放置30min；

3.6.2.3 4000 rpm，4 ℃離心20 min，棄上清，并在紙上倒置2min；

3.6.2.4加入1ml PBS重懸沉淀，將重懸液移至新的1.5ml離心管，12000rpm，4 ℃離心20min；

3.6.2.5將離心后的上清轉移至新的1.5ml離心管，加入1/4體積預冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混勻后冰上放置10min；

3.6.2.6 12000rpm，4 ℃離心10min，棄上清，加入1ml PBS重懸沉淀；

3.6.2.7 12000rpm，4 ℃離心2min，將上清轉移到新的1.5ml離心管中，即為噬菌體文庫，100μl /管分裝，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。

3.6.3噬菌體文庫效價檢測

3.6.3.1將-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固體培養(yǎng)基（Tet抗性）進行單菌落劃線，37℃過夜培養(yǎng)（4℃保存一周），從單菌落板上挑取一個單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；

3.6.3.2取過夜培養(yǎng)菌液250μl轉接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)約45min-60min后至OD600為0.5-0.55；

3.6.3.3取3.7.2方法制備好的噬菌體文庫10μl，在1.5ml離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋12個梯度，即將噬菌體文庫取10μl稀釋至100μl，再從中取10μl稀釋至100μl，依次類推，共稀釋12個梯度至10-12，振蕩混勻；

3.6.3.4在每個稀釋離心管中加入90μl的SS320菌液，混勻后37℃孵育30min；

3.6.3.5從每個稀釋離心管中取5μl滴加到2×YT固體培養(yǎng)基（Amp）中，37℃過夜培養(yǎng)；

3.6.3.6統(tǒng)計板上可以明顯區(qū)分單菌落的稀釋度的單菌落數量，并按照下面公式計算每毫升噬菌體溶液中噬菌粒的數量，即噬菌體文庫效價。

4.????實驗結果

4.1總RNA提取和反轉錄

4.1.1總RNA瓊脂凝膠電泳結果：

圖1羊駝PBMC總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果

4.1.2反轉錄cDNA結果：

4.2 PCR擴增

4.2.1第一輪PCR擴增

4.2.1.1確定最佳擴增模板量

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，oligo dT Primer轉錄后進行第一輪擴增使用2μl作為模板擴增條帶強清晰且無雜帶，選擇2μl為最佳擴增模板量；random 6-mers轉錄后進行第一輪擴增使用2μl作為模板擴增條帶清晰且無雜帶，選擇2μl為最佳擴增模板量。

圖2使用不同cDNA模板量的瓊脂糖凝膠電泳

4.2.1.2第一輪PCR擴增和回收

4.2.2第二輪PCR擴增

4.2.2.1確定最佳擴增模板量

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，第二輪擴增使用0.1μl作為模板擴增條帶清晰且無雜帶，選擇0.1μl為最佳擴增模板量。

圖3使用不同的第一輪PCR產物模板量的瓊脂糖凝膠電泳

4.2.2.2第二輪PCR擴增和回收

4.3載體和PCR產物酶切、連接

4.3.1酶切、連接檢測結果

4.4細菌文庫構建

4.4.1細菌文庫檢測

4.4.2陽性克隆率菌落PCR

菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，挑選的55個單克隆有53個為陽性克隆，陽性率為96%，細菌文庫陽性克隆率符合要求。

圖4菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結果

4.4.3序列多樣性

隨機挑選48個單克隆測序后使用GENtle軟件轉錄翻譯成蛋白質序列，序列多樣性比對顯示48個序列均為獨立序列，多樣性100%，細菌文庫多樣性符合要求要求。

圖5序列多樣性比對

4.5噬箘體文庫制備

4.5.1噬菌體文庫檢測