01

研究背景

氨基酸（AAs）和?；鈮A（ACs）是機(jī)體能量狀態(tài)的重要生物標(biāo)志物，對人體能量代謝至關(guān)重要。在常規(guī)臨床診斷中，特別是在新生兒篩查中，AA和AC可作為先天性代謝缺陷的診斷標(biāo)志物。然而，針對這些化合物的血清高通量分析的多分析方法很少，適用于幼兒和嬰兒的微量分析方法缺乏。

02

前言

2023年7月8日，德國慕尼黑工業(yè)大學(xué)Corinna Dawid教授與Thomas F. Hofmann教授團(tuán)隊(duì)在知名期刊J Agric Food Chem（IF=6.1，中科院農(nóng)林科學(xué)1區(qū))上發(fā)表了題為“High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS”的最新研究成果，該研究開發(fā)并驗(yàn)證了一種高通量HILIC-MRM-MS/MS方法，用于快速定量人血清中未分級的AA、AA衍生物和AC，提供了AA和AC代謝的廣泛分析以及定量代謝物數(shù)據(jù)。并且首次將該方法應(yīng)用于145個(gè)3-4個(gè)月月齡的健康嬰兒的血清樣本，結(jié)果顯示出多日分析的良好再現(xiàn)性，并能夠同時(shí)在該年齡組中進(jìn)行氨基酸和?；鈮A譜分析。

03

研究思路

這項(xiàng)研究通過對LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行探究，開發(fā)出一種針對AAs和ACs的新的靶向HILIC-ESI-MS/MS方法，能夠?qū)θ搜逯械?2種AA和AC代謝物進(jìn)行高通量分析，并解決了嬰幼兒血清高通量分析的技術(shù)難題。

04

研究方法

儀器

Exion UHPLC系統(tǒng) (Sciex, Darmstadt, Germany)

QTRAP 6500+ 質(zhì)譜儀 (Sciex, Darmstadt, Germany)

色譜質(zhì)譜參數(shù):

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 血清材料（ERNDIM, MCA Laboratory, Winterswijk, the Netherlands; product codes: AMI-02.1, AMI-02.2, CAR-02.1）;

2. 嬰兒血清樣品：145份健康的3-4個(gè)月月齡的嬰兒（(n = 145, age: 3.9 ± 0.5月, nfemale= 76, nmale?= 69）的血清樣本。

研究技術(shù):

靶向LC-MS/MS（Hilic）定量檢測技術(shù)

05

研究結(jié)果

研究者建立了一種新的

1.?方法開發(fā)

通過用甲醇處理血清樣品，將高效的分析物提取和綜合蛋白沉淀結(jié)合。在BEH酰胺柱上同時(shí)分離提取的AAs、AA衍生物和ACs，為所有不同極性的化合物提供了有效的分辨率（圖1）和良好的峰形。開發(fā)的UHPLC方法能夠分離幾種同量異位化合物，例如Leu [ID 10]/Ile [ID 9]/Cre[ID 30]/Hyp [ID 22] （圖2）。此外，在樣品檢查過程中總共添加了39種同位素或同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品，稱為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)分析（SIDA），以減少檢查過程中關(guān)于電離行為和基質(zhì)干擾的誤差。

圖1. UHPLC-MRM-MS/MS色譜參考標(biāo)準(zhǔn)混合洗脫順序在貝酰胺柱氨基酸和氨基酸衍生物（n = 40）和?；鈮A（n = 22）超過13 min，其次是沖洗和再平衡（未顯示），總運(yùn)行時(shí)間為20 min。

圖2. 混合嬰兒血清樣本中同量異位化合物的分離

2.?方法驗(yàn)證

在將UHPLC-MRMMS/MS方法應(yīng)用于嬰兒樣本之前，該方法根據(jù)美國食品和藥物管理局（FDA）指南進(jìn)行了分析程序和方法驗(yàn)證，該方法的性能和驗(yàn)證參數(shù)如表1所示。

基于加權(quán)的線性回歸模型(1/x；表1），在規(guī)定的校準(zhǔn)范圍內(nèi)，幾乎所有分析物的校準(zhǔn)曲線達(dá)到確定系數(shù)（R2）>0.99。并測定了LOD和LOQ。三次重復(fù)的LOQ的準(zhǔn)確性在88.2-119.7%之間，所有分析物的精密度（%CV）均低于14%。

表1. 線性范圍（LR）、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、確定系數(shù)（R2）、LOQ的精度（%CV）和具有標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的精度（%RE）

通過比較存在和不存在基質(zhì)時(shí)的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無論矩陣是否存在，校準(zhǔn)系列的斜率都很相似。然而，由于血清中天然代謝物含量的不同（圖3A，B），這表明不需要考慮基質(zhì)效應(yīng)。并且基于圖3結(jié)果，在溶劑中進(jìn)行了精確定量的校準(zhǔn)系列。

?

圖3.?矩陣效果

該方法的精度（表2）涵蓋了樣品制備（五次重復(fù)）和UHPLC-MS/ MS測量的可變性。通過凍融穩(wěn)定性測試，在所有QC水平上，濃度的變化沒有觀察到交叉分析的趨勢，表明沒有嚴(yán)重的凍融效應(yīng)，再次驗(yàn)證了該方法及其分析的代謝物的穩(wěn)定性（表2）。

表2.?日內(nèi)（d=1）和日間（d=3；個(gè)體）準(zhǔn)確度（%RE）和精密度（%CV），以及凍融穩(wěn)定性（[0?h]前和三個(gè)周期[72?h]后的±百分比變化）

?

3.?方法在三到四月齡嬰兒血清中的應(yīng)用

將開發(fā)的UHPLC-MS/MS方法應(yīng)用于3-4月齡的嬰兒的血清樣本，以證明其適用性。本文測定了54種分析物的定量圖譜（圖4），顯示其濃度高于LOQ，并且至少存在于60%的樣品中。

通過PCA檢測孔板、批次和采集日的潛在影響，發(fā)現(xiàn)PCA評分圖（圖5A）顯示了所有合并QCs的不同聚類。目視檢查未觀察到由孔板（圖5B)或采集日（圖5C)引起的聚集。因此，排除了技術(shù)變異性，再次確認(rèn)了所開發(fā)方法的重現(xiàn)性。由于少數(shù)樣本顯示了弱（H1）和強(qiáng)（H2）溶血，因此我們以溶血分級作為一個(gè)感興趣的變量進(jìn)行了PCA分析（圖5D）。溶血沒有收到明顯的聚集，這表明對測量的代謝物的影響可以忽略不計(jì)。

圖4. 3-4個(gè)月月齡的嬰兒血清中AAs

AA衍生物和ACs的濃度[μM]（n=145）測定

圖5. 嬰兒血清樣本組的PCA評分圖

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研究結(jié)論

1.?開發(fā)并驗(yàn)證了一種高通量HILIC-MRM-MS/MS方法，用于快速定量人血清中未充分利用的AAs、AA衍生物和ACs，能夠在20分鐘的運(yùn)行時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測62種代謝物。該方法提供了廣泛的AA和AC代謝圖譜以及定量代謝物數(shù)據(jù)。

2.?首次使用高通量、無衍生化和共高效的UHPLC-MRM-MS/MS測定3-4個(gè)月月齡的健康嬰兒血清中AA和AC濃度。

3.?該方法在多日的測量期間顯示出良好的重現(xiàn)性和無技術(shù)變異性，允許大樣本量的AA和AC代謝的個(gè)體圖譜。

本文開發(fā)并驗(yàn)證了一種高通量HILIC-MRM-MS/MS方法來快速定量人血清中的AAs和ACs。并且首次使用高通量、無衍生化和共高效的UHPLC-MRM-MS/MS測定3-4個(gè)月月齡的健康嬰兒血清中多種AAs和AC濃度，為靶向氨基酸代謝領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)?

1.?Wudy SI, Mittermeier-Klessinger VK, Dunkel A, Kleigrewe K, Ensenauer R, Dawid C, Hofmann TF. High-Throughput Analysis of Underivatized Amino Acids and Acylcarnitines in Infant Serum: A Micromethod Based on Stable Isotope Dilution Targeted HILIC-ESI-MS/MS. J Agric Food Chem. 2023 Jun 7;71(22):8633-8647. doi: 10.1021/acs.jafc.3c00962. Epub 2023 May 26. PMID: 37232935.

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文末看點(diǎn)｜lumingbio

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