Phalloidin-TRITC是一種紅橙熒光細(xì)胞骨架染色劑，它結(jié)合并標(biāo)記F-actin（激發(fā)/發(fā)射最大值λ~540/565nm）。建議將小瓶內(nèi)容物溶于1.5毫升甲醇或二甲基亞砜中，制成本品的儲備溶液。

產(chǎn)品名稱：羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽|TRITC Phalloidin

分子式：C60H70N12O13S2

分子量：1231.4

CAS：915013-10-4

結(jié)構(gòu)式：

運(yùn)輸與保存方法：冰袋運(yùn)輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

需要自備材料：

1） （可選）甲醇

2） 1×PBS 緩沖液, pH 7.4, 細(xì)胞培養(yǎng)級別

3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 緩沖液）

4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 緩沖液）

5） Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（不含 DAPI）DAPI

6） （可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含 DAPI）

7） （可選）BSA，標(biāo)準(zhǔn)級

8） 載玻片和蓋玻片

9） 蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）

10）組裝有 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片，以及 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。操作步驟：

1.工作液準(zhǔn)備

1）對于 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

本品以溶于甲醇的 20M 儲存液形式提供，總量為 300L。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 mL 的工 作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開始實(shí)驗(yàn)前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）對于 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

本品以凍干粉形式提供，分子量為 1231.4，總量為 1mg?？上扔眉状蓟蛘?DMSO 充分溶解配制成 20~100M 的儲存液。 如，加入 8.1208mL 甲醇到 1mg 鬼筆環(huán)肽即得到 100M 等量的儲存液，根據(jù)單次使用量，進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍 存，一年穩(wěn)定。開始實(shí)驗(yàn)前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.染色步驟

1）細(xì)胞爬片生長 24h，使其密度達(dá)到 50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞 2 次。

3）使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定 10min。

注：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動蛋白。

4）室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5min。

6）室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。

7）取 200l 配制好的 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育 30min（通常情況下，4℃~37℃ 孵育皆可）。

注：為了降低背景，可于 TRITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可 將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

8）用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5min。

9）使用 200l DAPI 溶液（濃度：100 nM）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約 30s。

10）用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封 片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。

注：也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟 9）10），簡化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=545/570nm）和 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾 片（Ex/Em=364/454nm）。

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