易基因｜高通量測序后的下游實驗驗證方法——DNA甲基化篇
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。
此前，我們分享了DNA甲基化研究的測序數(shù)據(jù)挖掘思路，進而鑒定出研究的目的基因或目標區(qū)域的DNA甲基化。
做完測序后，如果需要對分析結果中感興趣的內容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。DNA甲基化研究的后期驗證包括簡單驗證、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證等。
一、簡單驗證
目標基因DNA甲基化的驗證：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
?二、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）
DNA甲基化干擾：
DNA甲基化酶的敲降/敲除/過表達
DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價鍵抑制其酶活性，使細胞的DNA甲基化水平降低。
檢測整體DNA甲基化變化：
5mC甲基化免疫熒光染色（定性）
DNA斑點雜交（定性）
比色法（定量）
質譜法（定量）
檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
三、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證
目的基因DNA甲基化的干擾：
熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基轉移酶在體外將質粒進行甲基化，構建含甲基化/未甲基化啟動子的目標基因-熒光素酶表達質粒。
CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實驗：在細胞中人為表達目的基因，或通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
檢測細胞功能受到的影響:
免疫熒光顯微觀察
功能標志物測定
... ...
目標區(qū)域DNA甲基化的驗證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測序）
靶向特定區(qū)域進行超高深度甲基化測序。
超高深度：可達幾百到幾千乘。
單個區(qū)域長度<300bp
需要設計BS引物，進行預擴增實驗。
WGBS vs. TBS相當于RNA-seq vs. RT-qPCR
關于易基因靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）
對目標基因/CpG 位點甲基化檢測，建立靈活的靶向甲基化測序技術。易基因建立的靶基因甲基化高通量測序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是針對已有目標基因panel組合，運用易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設計軟件，對亞硫酸鹽轉化后的目標基因多重擴增，建庫后進行超高深度（1000X以上）甲基化精準檢測。
應用方向：
Target-BS廣泛用于已知位點的甲基化Biomarker篩選、驗證及臨床轉化應用
后續(xù)目標基因的甲基化驗證
技術優(yōu)勢：
多基因多重擴增，檢測通量高；
超高深度亞硫酸鹽甲基化測序，相對于傳統(tǒng)BSP克隆測序，檢測靈敏度、準確性高，可準確檢測到樣本中低于1%的甲基化水平；
樣本需求量低，20ng基因組DNA可實現(xiàn)多基因擴增；
適用范圍廣，對基因組DNA、FFPE樣本、游離cfDNA等樣本均適用；
檢測費用顯著低于現(xiàn)有技術、快周期、超高性價比。
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位點甲狀腺結節(jié)診斷
Target-BS發(fā)現(xiàn)食管鱗癌甲基化 biomarker
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術詳情了解請致電易基因。
