具有良好特征的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織對于未來的生物標志物發(fā)現(xiàn)研究具有重要價值，而高通量和良好重復性的方案在蛋白質(zhì)組學中是必不可少的。2021年01月01日，來自隆德大學生物醫(yī)學工程專業(yè)Melinda Rezeli教授團隊在Journal of Proteome Research雜志上在線發(fā)表了題為“Proteomic Workflows for High-Quality Quantitative Proteome and Post-Translational Modification Analysis of Clinically Relevant Samples from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Archives”的研究論文。該研究提出了一種針對FFPE組織優(yōu)化的可重復的樣本制備工作流程，并首次證明了在FFPE組織中研究內(nèi)源性賴氨酸乙酰化是可行的，有助于更好地利用現(xiàn)有的組織檔案。

研究背景

在過去的十年中，F(xiàn)FPE組織的使用在蛋白質(zhì)組學研究人員中引起了越來越多的興趣，尤其是在癌癥研究領(lǐng)域。在癌癥研究中，賴氨酸乙?；确g后修飾的研究非常重要，因為它涉及許多細胞過程，包括代謝途徑和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。因此，可以在FFPE組織樣本中研究內(nèi)源性乙?；欠浅Ｓ袃r值的。

文章重點

該研究介紹和評估了S-Trap技術(shù)在基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學FFPE生物樣品處理中的應用。該研究使用不同F(xiàn)FPE組織類型樣本，使用高度重復性的S-Trap消化方法。TMTpro-16plex可直接在S-Trap洗脫的多肽上進行標記，不需要額外的除鹽步驟，減少了樣品處理流程和處理時間。此外，作者還開發(fā)了一種基于S-Trap的內(nèi)源性乙?；目焖贅悠分苽浞桨?，并且證明了研究FFPE組織樣本中的內(nèi)源性乙?；怯幸饬x和有效的。

樣本策略

17例肺腺癌（LUAD）患者的FFPE組織樣本；3例惡性黑色素瘤（MM）的FFPE組織樣本和冰凍組織樣本；扁桃體FFPE組織

研究思路

研究結(jié)果

無二甲苯脫蠟和蛋白質(zhì)提取結(jié)合S-Trap消化

該研究使用了一種無二甲苯的脫蠟方法，該方法能夠有效地去除大塊石蠟，而不會造成任何實質(zhì)性的蛋白質(zhì)損失。對于蛋白質(zhì)提取，使用兩種緩沖液(1)含有25 mM DTT和10%-SDS的100 mM TEAB緩沖液（稱為SDS緩沖液）和(2)含有8M尿素的100 mM AmBic緩沖液（稱為尿素緩沖液）。提取后，將等量的蛋白質(zhì)加載到S-Trap柱上，并在消化之前洗去提取緩沖液。然后采用雙酶（LysC-胰酶）消化，在用胰酶消化過夜之前增加兩小時的LysC消化步驟，以減少漏切并提高了消化的重復性。兩種提取方法在蛋白質(zhì)水平上觀察到相似的鑒定數(shù)量和大量重疊情況?(SDS: 4577?；尿素: 4263) (圖1A)?。為了評估實驗重復之間的定量重復性，對常見的蛋白質(zhì)進行了Pearson?相關(guān)性分析（圖1C）。在SDS和尿素樣品中蛋白質(zhì)豐度的所有配對比較之間都觀察到了很好的相關(guān)性，所有重復比較的r都在0.98以上。這證明了S-Trap消化方法的高實驗重現(xiàn)性和良好性能。此外進一步分析了這兩種提取方法所獲得的蛋白質(zhì)組，對所有鑒定的蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)進行了評估（圖1D、E）?？偟膩碚f，這兩種方法顯示出高度相似的分布模式，無論是相互比較，還是與理論上的人類蛋白質(zhì)組相比都是如此。

S-Trap消化結(jié)合TMT標記

本文的S-Trap消化方式與TMT標記兼容，而不需要額外的樣本處理。采用SDS蛋白提取方法針對LUAD患者標本使用96孔板進行S-Trap消化，然后用TMTpro-16plex標記。結(jié)果顯示標記效率在99%以上，表明了從S-Trap洗脫出來的多肽與TMT標記方案是兼容的，并且標記前沒有進行多肽除鹽。該方法減少了樣品處理步驟，增加了樣品回收率，并縮短了準備時間。共分析了14例LUAD患者的原發(fā)腫瘤樣本，采用高pH-RP分餾共計24個組分，共鑒定到143,048個多肽，9585個蛋白，7936個可定量蛋白。接下來探索了與患者生存相關(guān)的蛋白質(zhì)和途徑，使用關(guān)鍵蛋白進行層次聚類分析（圖2A）。在存活四年以上的患者中，觀察到與免疫系統(tǒng)、翻譯、細胞激活、應激反應、蛋白質(zhì)運輸和蛋白質(zhì)輸出相關(guān)的通路顯著富集，而對于診斷后存活不到四年的患者，觀察到與DNA修復、蛋白質(zhì)修飾過程和運動相關(guān)的通路顯著富集（圖2B）。火山圖顯示存活時間短的患者中有19種蛋白質(zhì)上調(diào)（紅點）和存活時間長的患者（藍點）中的有33種蛋白質(zhì)上調(diào)（圖2C）。在?52?種差異表達的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了與預后和生存相關(guān)的候選蛋白，例如GZMA、CD40、TAP1、SDC4和APOA1。

S-Trap方法研究內(nèi)源性賴氨酸乙?；?/strong>

為了研究內(nèi)源性乙?；髡唛_發(fā)了一種基于S-Trap的快速樣品制備方案，其中包括使用氘化N-acetoxisuccinimide對蛋白質(zhì)的游離氨基進行化學乙?；员隳軌蛟贛S分析中區(qū)分化學標記的乙?；蛢?nèi)源性乙酰化。由于胰蛋白酶在存在乙酰賴氨酸的情況下不能裂解肽鍵，因此消化的肽將只切割精氨酸殘基，這導致與經(jīng)典胰蛋白酶消化所形成的肽是不同的。作者利用扁桃體FFPE組織來評估基于S-Trap的乙?；桨?，并將其與常規(guī)胰酶消化進行比較，每種方法進行三次技術(shù)重復。兩種方法蛋白質(zhì)水平的鑒定數(shù)目非常相似，S-Trap的乙?；桨歌b定出5191個蛋白，常規(guī)胰酶方案鑒定出5103個蛋白質(zhì)。為了探索這兩種方法的互補性，研究了兩種方法之間的蛋白質(zhì)重疊。在蛋白質(zhì)水平上觀察到68.8%的重疊（圖3C），顯示了所獲得的蛋白質(zhì)組的互補特征。然而，鑒定的蛋白質(zhì)序列的平均賴氨酸含量（鑒定序列中的K頻率）在乙?；ㄖ懈哂诮?jīng)典胰酶消化法，中位數(shù)分別為5.6%和4.0%。因此，乙?；椒赡苡兄谘芯扛缓琄的蛋白質(zhì)區(qū)域。為了研究S-Trap乙?；桨甘欠窨梢杂米鱾鹘y(tǒng)胰酶消化方案的補充或替代方案，斯皮爾曼相關(guān)性分析(圖3E，相關(guān)系數(shù)為0.80-0.81）顯示兩種方法具有較好的一致性，S-Trap乙?；椒瓤捎糜谘芯績?nèi)源性賴氨酸乙?；?，也可用于整體蛋白質(zhì)組研究。

在扁桃體FFPE組織中共鑒定到1339個蛋白質(zhì)中的1839個內(nèi)源性乙?；亩?。其中1034個之前已被報道過乙?；鶕?jù)PhosphoSitePlus (v.6.5.9.1) (www.phosphosite.org)。這些結(jié)果表明，大約26%的所有已鑒定蛋白含有至少一個乙?；稽c，這與之前的研究報告的蛋白質(zhì)水平25%至30%的乙?；喈敗榱诉M一步評估研究FFPE組織內(nèi)源性賴氨酸乙?；目煽啃?，使用來自3名MM患者的成對FFPE和冰凍組織樣本對所開發(fā)的方法進行了評估?？梢澡b定出2336和2665個內(nèi)源性乙?；模謩e對應于FFPE和冰凍組織中的1698和1884個蛋白質(zhì)，其中超過70%以前報道為乙?；?。

為了論證在FFPE組織中研究賴氨酸乙?；目尚行?，以含有兩個賴氨酸殘基的組蛋白H3肽（KSTGGKAPR）為例，比較了FFPE和冷凍組織中的定量分布。圖4A顯示了具有不同內(nèi)源性乙酰化程度的H3肽的串聯(lián)質(zhì)譜圖，還展示了每個乙酰化狀態(tài)的相對比例(圖4B)。與冷凍組織樣本相比，F(xiàn)FPE中觀察到的相對比例略有增加?？傮w而言，同一組織類型內(nèi)不同患者之間的關(guān)系非常相似，可以得出結(jié)論，F(xiàn)FPE組織中的乙酰化定量分析與冷凍組織樣本分析一樣，對于患者之間的相對比較是有效的。

綜上所述，與S-Trap相適應的乙酰化方法具有很好的定量重復性，在多肽和蛋白質(zhì)水平上的變異系數(shù)都很低。此外，還證明了乙酰化方案是對經(jīng)典胰酶消化的一個很好的補充，可以增加蛋白鑒定的數(shù)量。乙酰化方法也可以作為經(jīng)典胰酶消化的替代方法，以實現(xiàn)對內(nèi)源性乙?；驼w蛋白質(zhì)組的同時評估。作者還證明了研究FFPE組織樣本中的內(nèi)源性乙?；怯幸饬x和有效的，配對的FFPE組織樣本與冷凍組織樣本的結(jié)果是一致的。這項研究旨在促進世界各地所有有價值的FFPE檔案的使用，改變我們在蛋白質(zhì)組學研究中看待FFPE樣本的方式。

福爾馬林固定石蠟包埋檔案中臨床相關(guān)樣本的高質(zhì)量定量蛋白質(zhì)組工作流程及翻譯后修飾分析

期刊名稱：Journal of Proteome Research

影響因子：4.074

樣本選擇：FFPE組織和冷凍組織

技術(shù)策略：蛋白質(zhì)組學和乙酰化蛋白質(zhì)組學

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