轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）是基于第二代高通量測序技術(shù)進行cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)是一項很成熟的技術(shù)，但因為樣品準備方法的錯誤或者運輸條件的不合理而導(dǎo)致RNA降解事件卻時有發(fā)生，讓很多小伙伴頗為擔(dān)心。今天，小編就結(jié)合既往經(jīng)驗，為大家奉上轉(zhuǎn)錄組測序送樣指南，希望對大家有所幫助！

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一、樣本收集的基本原則

代表性：

根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇合適取樣方案，這將有利于實驗結(jié)果真實反映樣本的本質(zhì)信息。

準確性：

組織取材部位要準確，正確識別所要研究的組織部位，剔除與研究無關(guān)的組織部位，在條件允許的前提下，爭取做到實驗組與對照組樣本在取材時間、部位、處理條件等方面盡可能保持一致。

及時性：

鑒于RNA結(jié)構(gòu)的特殊性，極易降解，且易受到RNase的影響，因此在樣本采集、貯存、運輸和制備的過程中應(yīng)盡可能地在規(guī)范操作的同時保持迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實驗的時間。

無污染性：

所用實驗試劑及器皿需經(jīng)去RNA酶處理，處理樣本的試劑需用RNase-free水配制。

低溫性：

所取樣本離體后，如有分離步驟在4℃或冰上進行，分離好的樣本立即置于液氮中速凍15 min以上，-80℃保存，干冰運輸，以避免RNA的降解。

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二、送樣量建議

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您的樣本不在上述列表內(nèi)可與小編聯(lián)系哦！

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注意事項：

1） 若開展的實驗項目為miRNA的相關(guān)實驗，請確認采用的總RNA的提取方法保留了小RNA（包括miRNA）。

2） 避免紫外和反復(fù)凍融，不可存放于高溫狀態(tài)和極端pH溶液中（pH<6或pH>9）。

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三、樣本收集方法

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01動物組織

1、燒杯中倒入50 mL DEPC水（每解剖一個生物學(xué)樣本換一次DEPC水）。

2、從動物活體取材獲得組織后，快速用

預(yù)冷的RNase free水漂洗

，以去除血漬和污物，并剔除結(jié)締組織和毛發(fā)等非研究組織（組織樣品處理及切割過程在冰上迅速進行；樣本離體后，建議在3 min內(nèi)完成組織取樣及液氮速凍，時間過長會導(dǎo)致樣本的RNA降解）。

3、將采集到的組織迅速放入含有

預(yù)冷的RNase-free水

的帶螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL EP管/凍存管中，立即液氮速凍15 min以上，隨后-80℃保存，足量干冰寄送。

注意事項：

1） 解剖活體特定組織樣本時，在含有DEPC水的燒杯中涮干凈表面血液（動作迅速，需要在幾秒內(nèi)完成）。

2） 實驗前，將所有用到的燒杯內(nèi)外表面、錫箔紙表面、鑷子、解剖剪和刀片分別用無水乙醇和無紡布蘸RNAzap擦拭一遍；實驗過程中，用

RNAzap擦拭

。

3） 對于需要RNAlater（Ambion，AM7020）及類似保存液保存的樣本，請嚴格按照操作說明進行。

4） 請勿寄送用裂解液保存的組織樣本；動物及臨床組織禁止使用錫箔紙、自封袋包裹。

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02植物組織

1

、

選取新鮮、幼嫩、生長旺盛的組織部位樣本，在活體狀態(tài)下擦凈組織表面灰塵和雜質(zhì)。

2、取樣，迅速放入

預(yù)冷好的有標記的RNase-free的螺紋凍存管

中，或用標記好名稱（名稱朝外）的錫箔紙包裹好（禁止使用自封袋、一次性PE手套包裝樣品），液氮速凍15 min，轉(zhuǎn)移到-80℃保存，足量干冰寄送。

注意事項：

植物組織不要使用RNAlater保存，因為植物組織含有細胞壁及次生壁，RNAlater不易滲透入組織內(nèi)部；也勿用Trizol直接浸泡植物組織。

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03細胞

1、懸浮培養(yǎng)細胞

1） 選取

生長狀態(tài)良好

的細胞懸液，200g離心5 min，去上清。

2） 加入適量1×PBS（DEPC水配置）清洗細胞，200g離心5 min，去上清，清洗2次。

3） 加入適量的裂解液（TRIzol推薦Ambion），反復(fù)吹打至細胞充分裂解（渦旋震蕩也可），將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無酶管中，-80℃保存，足量干冰寄送。

2、貼壁培養(yǎng)細胞

1） 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細胞，確認

細胞的完整性

（破裂的細胞會釋放出RNA酶降解RNA）。

2） 使用預(yù)冷的1×PBS（DEPC水配置）清洗貼壁細胞2次。

3） 加入適量的裂解液（TRIzol推薦Ambion），用移液器充分吹打使細胞

充分裂解

（細胞與裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液體，且沒有細胞團塊殘留），將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無酶管中，-80℃保存，足量干冰寄送。

注意事項：

1） 細胞樣品必須裂解充分后再寄送，勿將凍存的細胞直接寄送，因為細胞冷凍的過程中冰晶很容易刺破細胞，此時破碎的細胞會釋放內(nèi)源性RNase，從而降解RNA。

2） 進行細胞裂解的操作時，如果發(fā)現(xiàn)細胞樣品始終粘度很大，說明該細胞樣品仍未裂解充分，此時應(yīng)繼續(xù)補加裂解液，以100 μL為梯度進行補加，直到樣品完全裂解充分。

3） 細胞樣品勿用胰酶消化，胰酶會消化細胞膜上的膜蛋白，導(dǎo)致細胞破裂，破裂的細胞會釋放RNase導(dǎo)致RNA降解。

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04血液

1

、人全血

建議收集時

使用PAXgene管

，于18-25℃可以保存3天，2-8℃可以保存5天，-20/-80℃可以保存8年；原則上需要-80℃保存，足量干冰寄送。

2、其他動物全血

1）?每個樣本均取新鮮血液1 mL于含有EDTA的抗凝管（紫色管帽）中，混勻。取血過程務(wù)必保持潔凈。隨后，將采集好的全血用移液器以250 μL/管快速分裝至1.5 mL離心管中，每管加入750 μL TRIzol LS，混勻，液氮速凍15 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

2）?分離血細胞（約10-15 mL的全血）溶于1 mL TRIzol，混勻，液氮速凍15 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

3、血漿（ncRNA轉(zhuǎn)錄組測序）

將使用抗凝管所得的血漿分裝至1.5 mL的離心管中，每管1 mL，-80℃保存，足量干冰寄送。

4、血清（ncRNA轉(zhuǎn)錄組測序）

將未使用抗凝劑分離所得的血清樣本分裝至1.5 mL的離心管中，每管1 mL，-80℃保存，足量干冰寄送。

5、PBMC

分離得到PBMC后，加入適量TRIzol裂解液，充分裂解好。隨后，-80℃保存（每5 mL全血PBMC后加入1 mL TRIzol，不要在PBMC后加入任何凍存液）。

注意事項：

1） 血液務(wù)必在離體

兩小時內(nèi)

處理好并加入Trizol LS混勻，兩小時后血液內(nèi)mRNA開始降解，后續(xù)提取可能會不合格。

2） 血漿、血清在冰凍狀態(tài)下應(yīng)呈淡黃色，或黃色，如果呈紅色或淡紅色，則為溶血樣品，視為不達標，不予提取；室溫融化后，其應(yīng)為淡黃色，或黃色澄清透明的液體，如有絮狀不溶物或混濁狀態(tài)視為不達標，不予提取。

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05細菌

1、取1 mL

對數(shù)期

（OD600=0.6-0.8）的新鮮菌懸液于1.5 mL無酶管中10000 rpm 4℃離心2 min，充分去除上清，然后重復(fù)幾次離心或分多管離心收集菌體沉淀，沉淀量需達到1.5 mL離心管的約200 μL處。

2、將菌體迅速置于液氮中冷凍15 min，-80℃保存，足量干冰寄送。

注意事項：

1） 請務(wù)必保證菌體培養(yǎng)時無污染，為單一菌種；如菌種經(jīng)過處理，請通過顯微鏡確保菌體是否還是

活菌狀態(tài)

。

2） 務(wù)必收集對數(shù)期菌體，并盡可能地吸凈培養(yǎng)基，菌體過老或培養(yǎng)基殘留會嚴重影響后續(xù)的提取結(jié)果。

3） 使用無菌生理鹽水或無菌 PBS 清洗菌體沉淀。

4） 請不要以菌體的形式寄送有毒性、致病性的細菌或者以液體形式（菌液）寄送任何細菌樣本。

5） 菌體若經(jīng)過特殊處理，會出現(xiàn)RNA條帶異常，請送樣時在訂單里詳細備注，否則可能會造成樣本的浪費。

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06糞便

1、清晨采集動物的新鮮糞便樣品，放于無菌離心管或其它無菌容器中。

2、樣品帶回實驗室后分裝至5 mL或更大體積的離心管或凍存管中（新鮮糞便樣品稱取200 mg置于5 mL離心管中，即滿足單次提?。?.5 mL Ambion生產(chǎn)的RNAlater? Solution，渦旋混勻，每個樣品3-5個重復(fù)，4°C過夜。

3、4°C過夜后，液氮速凍3-5 min，-80°C保存，足量干冰寄送。

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07土壤

1、選取采樣地點，除去土壤表層未分解的凋落物層，先多點（8-10點）采集土壤表面腐殖質(zhì)層，然后用土壤取樣器隨機多點（8-10點）分別采集0-10 cm及10-25 cm土層土壤混合樣品。

2、樣品帶回實驗室后過2 mm篩后（如果是含水量較高不適合過篩的可不用過篩），分裝至5 mL或更大體積的EP管或凍存管中，每管分2-3 g，每克土壤加2-2.5 mL Mobio生產(chǎn)的Life Gurad Soil Preservation Solution（如果是沉積物等含水量較高的樣品，每克加入3 mL Life Gurad Soil Preservation Solution），每個樣品5-8個重復(fù)。

3、渦旋或手動搖勻，使所有土壤

完全潤濕

，此時Life Gurad Soil Preservation Solution的液面應(yīng)該高于土樣，根據(jù)實際條件-20°C或-80°C保存樣品，足量干冰寄送。

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四、通用要求

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1、

樣品命名：

“樣品名稱”應(yīng)避免出現(xiàn)漢字，請采用字母和數(shù)字表示，長度控制在8個字符以內(nèi)，最好能體現(xiàn)出其生物學(xué)屬性和取樣情況。

2、

樣品標識：

請勿僅使用標簽紙進行樣品標記，標簽紙經(jīng)液氮冷凍過后易脫落，造成樣品混亂；可以使用質(zhì)量較好的油性筆在樣本管上清晰地標記好樣本名稱，同時也寫在標簽紙上，貼在管壁，再用透明膠帶纏繞一圈，防止脫落。

3、

樣本包裝：

液體樣品，建議使用螺旋口的離心管運輸，并使用Parafilm密封離心管口。保存時，請將所有樣品管裝于一個自封袋或凍存盒中，做好標記，以防樣品丟失。

4、

樣品寄送：

干冰運輸時，請選用保溫性好的泡沫盒（建議壁厚2公分以上）進行樣品存放，準備8-10 kg粒狀或塊狀干冰（粉末狀干冰較易揮發(fā)），以提供低溫的樣品保存環(huán)境。血液類樣本從樣本收集到送樣，最好不要超過15天，其他樣本則為3個月。在選擇與委托快遞公司時，應(yīng)事先確認預(yù)計送達的時間，并且在運輸過程中隨時跟蹤貨物的情況，您在記錄運單號的同時請務(wù)必在《技術(shù)服務(wù)樣品提交單》填寫您的運單號，以便我們與您一起追蹤樣品的運輸狀態(tài)。

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如果您目前有合適的樣本類型，正在苦惱如何開展組學(xué)方面的研究，那么歡迎咨詢我們奧維森基因哦！