實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

1.?掌握大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌的原理；

2.?了解制備感受態(tài)細(xì)胞的方法及原理；

3.?掌握轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法

實(shí)驗(yàn)原理：

轉(zhuǎn)化（transformation）是將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞使后者獲得新的遺傳性質(zhì)的一種方法。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶（R-，M-），外源DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)不會被降解，可以穩(wěn)定的遺傳給后代。宿主細(xì)胞經(jīng)過電轉(zhuǎn)化、CaCl2等處理之后，其細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（competent cells）。

本實(shí)驗(yàn)中使用的受體細(xì)胞為大腸桿菌BL21（DE3）菌株，該菌株用于表達(dá)克隆于含T7噬菌體啟動子的表達(dá)載體上的基因，如pET、pGEX系列表達(dá)載體。BL21（DE3）菌株的染色體BL21區(qū)上整合了λ噬菌體的DE3的DNA片段，該片段含有編碼T7 RNA聚合酶的基因，該基因受lac?UV5啟動子控制。當(dāng)整合有外遇基因的pET重組載體進(jìn)入BL21（DE3）細(xì)胞后，無T7 RNA聚合酶結(jié)合于T7啟動子；當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)后，解除了lac?UV5啟動子的阻遏，表達(dá)出T7 RNA聚合酶并結(jié)合在載體的T7啟動子上，啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)材料：

1、試劑：實(shí)驗(yàn)二的連接產(chǎn)物（pEasy E1-gfp），LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素；

2、菌株：大腸桿菌BL21（DE3）菌株感受態(tài)細(xì)胞；

3、實(shí)驗(yàn)器具：制冰機(jī)、水浴鍋、培養(yǎng)箱、酒精燈。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、將實(shí)驗(yàn)二的連接產(chǎn)物（pEasy E1-gfp）與剛?cè)诨拇竽c桿菌BL21（DE3）菌株感受態(tài)細(xì)胞溫和混勻，冰浴30min；

2、感受態(tài)細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)至42℃熱激90sec后冰浴10min；

3、加入300μl LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時；

4、4000rpm離心2min，取200μl，棄之；剩余培養(yǎng)物溫和混勻后涂布于含AMP的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)12h。

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