提取細(xì)胞總RNA

①在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并將實(shí)驗中所需要的試劑預(yù)先放進(jìn)冰箱中預(yù)冷。用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞表面，目的是為了減少培養(yǎng)基中的成分對提取總RNA的干擾，以6孔板為例，該操作要小心細(xì)致，每孔加入1?ml磷酸鹽緩沖液，注意將磷酸鹽緩沖液打到6孔板側(cè)壁上，不要直接沖擊細(xì)胞，以免造成細(xì)胞損耗，輕輕晃動6孔板使細(xì)胞清洗充分，棄去磷酸鹽緩沖液。該操作予以3次重復(fù)。

②吸凈磷酸鹽緩沖液，避免磷酸鹽緩沖液稀釋Trizol。Trizol放入4℃冰箱預(yù)冷，向6孔板內(nèi)每孔加入1?ml的Trizol裂解細(xì)胞，若用12孔板提取細(xì)胞，則每孔加入500 ul的Trizol。將6孔板置于冰上15 min，也可以放置于4℃實(shí)驗室搖床上搖動10 15 min，加速其裂解，等到充分裂解細(xì)胞后，肉眼可見Trizol更加濃稠，用無酶槍頭將細(xì)胞吹打下來，此過程中注意個人防護(hù)，Trizol有腐蝕性，因此注意動作輕柔，保護(hù)好裸露在外的皮膚。

③將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml無酶EP管中，每孔1?ml?的Trizol加入200 ul的氯仿，如果用12孔板，每孔500 ul的Trizol加入100 ul氯仿。劇烈震蕩混勻30?sec，冰上靜置15 min。

④離心機(jī)調(diào)至4℃預(yù)冷，在4℃下12?000 rpm/min離心15 min。

⑤將EP管從離心機(jī)中取出，注意動作輕柔，此時EP管內(nèi)液體分層明顯，上層無色水樣液體，含RNA。用無酶槍頭小心吸取上層無色液體，注意不要觸及中間分界的白色和下層紅色液體，如果吸力太大可以用黃色槍頭套白色槍頭，減小吸力。將無色上清液轉(zhuǎn)移至新的無酶EP管中，該操作要小心輕柔，如果一旦觸及混合層，或者吸力太大，將液體再次離心分層即可。記錄吸取的液體量，以免對后續(xù)實(shí)驗造成影響。

⑥在前期準(zhǔn)備中，預(yù)先將異丙醇放入4℃冰箱預(yù)冷，以免對RNA的提取造成影響，使RNA降解。向無酶EP管中加入與上清液等體積的異丙醇，輕柔混勻15?sec，冰上靜置15 min。該步驟可以根據(jù)實(shí)驗需要，混勻后放入-30 ℃冰箱進(jìn)行過夜沉淀。

⑦離心機(jī)調(diào)至4℃預(yù)冷，在4℃下12?000 rpm/min離心15 min。

⑧將EP管從離心機(jī)中取出，注意動作輕柔，此時EP管內(nèi)底部有少許白色沉淀，棄去上清液。無水乙醇放入4℃冰箱預(yù)冷，用DEPC水稀釋成75%乙醇。每只EP管中加入1?ml的75%乙醇，用無酶槍頭將沉淀吹起懸浮洗滌，如果吸力太大可以用黃色槍頭套白色槍頭，減小吸力，注意不要吸走沉淀。離心機(jī)調(diào)至4℃預(yù)冷，在4℃下12 000 rpm/min離心15 min。棄去上清液，再次向每只EP管中加入1 ml的75%乙醇，重復(fù)洗滌步驟，再次離心。

⑨棄去上清液，將EP管倒扣放在干凈紙巾上，用干凈棉簽小心擦去EP管內(nèi)殘留75%乙醇，注意不要擦去沉淀，靜置10?min。根據(jù)RNA沉淀量加入適量DEPC水混勻，輕柔吹打，溶解RNA。在EP管上標(biāo)記提取時間、細(xì)胞名稱、EP管編號、實(shí)驗人員姓名等基本信息。

2)?檢測RNA的含量和純度

①打開NANO DROP 2000系統(tǒng)，用1?ul?的DEPC水洗滌分光光度計，該操作重復(fù)3次。每管上樣1 ul的RNA樣品，測定RNA濃度和純度。通過在260 nm和280 nm處的光密度值（OD）計算RNA的含量和純度。

②RNA最好逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA的形式儲存。若暫不逆轉(zhuǎn)錄，則將RNA凍存于﹣80℃冰箱，避免反復(fù)凍存造成RNA降解。