?緩沖溶液是一類(lèi)能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱(chēng)為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱(chēng)之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。

? 緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，而且受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活動(dòng)需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程有體內(nèi)過(guò)程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開(kāi)發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測(cè)定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。下表列出某些人體體液的pH值：? ? ? ? ??

? ? ? ? ? ? 表1?人體體液pH

? 體 液? ? ? ? ??pH? ? ? ? ? ? ? ? ? ?體 液? ? ? ? pH

? 血 清? ? 7.35～7.45? ? ? ? ? 大腸液? ? 8.3～8.4

? 成人胃液 0.9～1.5? ? ? ? ? ?? ? 淚? ? ?6.6～6.9?

? 唾 液? ? ?? 6.3～7.1? ? ? ? ? ? ? ?尿? ? ?4.8～7.5

? 胰 液? ? ? ?7.5～8.0? ? ? ? ? 腦脊液? 7.35～7.45

1 基本概念

? ⑴ Br?nsted-Lowry酸堿理論（又稱(chēng)酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Br?nsted和英國(guó)化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說(shuō)，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱(chēng)為酸堿質(zhì)子理論或Br?nsted-Lowry酸堿理論。他們認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等）稱(chēng)為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl—等）稱(chēng)為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱(chēng)為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對(duì)應(yīng)的酸，稱(chēng)為該堿的共軛酸。? ? ? ? ?

? ? ? ? ?A—H ＋ B—? ? ?A ＋ B—H

? ? ? ? ?酸1? ?堿2? ? ?堿1? ?酸2

? 酸1 是 堿1的共軛酸， 堿2 是 酸2 的共軛堿。

? ?如鹽酸在水中的解離：? ? ??

? ? ? ?HCl? ? Cl— ＋ H+??

? HCl是酸，Cl—是它的共軛堿。

? ⑵ 緩沖體系的設(shè)計(jì)：

? 強(qiáng)電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負(fù)離子，弱電解質(zhì)溶于水時(shí)，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負(fù)離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時(shí)，只有部分HA解離為 H+ 和 A—離子，其平衡方程式如下：

? ? ? ? ? ? ?K1

? ? ? ? HA? ? ? ?A— ＋ H+? ? ? ? ? ? ?(1-1)

? ? ? ? ? ? ?K2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ∴? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? (1-2)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

? (1-2)式兩邊取負(fù)對(duì)數(shù)：? ? ? ? ?(1-3)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

? (1-3)式中： [HA] — 為弱酸的濃度

? ? ? ?[H+] — 為HA解離出的氫離子濃度

? ? ? ?[A—] — 為HA的共軛堿的離子濃度

? ? ? ? K1 — 為酸解離的速度常數(shù)?

? ? ? ? K2 — 為A—與H+ 締合的速度常數(shù)

? ? ? ? Ka — 為反應(yīng)方程(1-1)達(dá)平衡時(shí)HA的解離平衡常數(shù)

? 現(xiàn)將HA的pKa 定義為 －lg Ka，將HA溶液的pH定義為 －log[H+]，?

∴ (1-3)式可寫(xiě)為 ：? ? ? ? ? ? ? ?(1-4)

? ? 或：? ? ? ? ? ? ? ? (1-5)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? 方程(1-4)稱(chēng)為：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對(duì)于生物化學(xué)學(xué)科，在理論與實(shí)踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質(zhì)中可解離基團(tuán)pKa之間的關(guān)系。很明顯，當(dāng)[A—]＝[HA]時(shí)：? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ?∴? ?pH ＝ pKa

這就意味著當(dāng)[HA]有一半解離時(shí)，溶液的pH等于 pKa，此弱酸－堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點(diǎn)。一個(gè)緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKa值為中點(diǎn)的兩個(gè)pH單位范圍內(nèi)，即：緩沖劑的有效pH范圍＝pKa±1，所以，當(dāng)緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的pKa時(shí)，緩沖能力最大。若要設(shè)計(jì)一個(gè)新的緩沖體系時(shí)，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進(jìn)行挑選即可。

1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：

? ?① pKa值在6～8之間； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 鹽效應(yīng)小；⑤ 離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響?。虎?不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀； ⑦ 該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧ 紫外和可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)光吸收??；⑨ 易制得高純度的鹽。

? 按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑來(lái)配制所需的緩沖溶液。

2 生物化學(xué)常用緩沖液

? ⑴ 磷酸鹽緩沖液

? 磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬：

? ? ? NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21??

? ? ? Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32

? ?配酸性緩沖液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4，

? ?配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH＝6～8，

? ?配堿性緩沖液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。

? 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。

? 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響小；④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。

? 其缺點(diǎn)為：①易與常見(jiàn)的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會(huì)抑制某些生物化學(xué)過(guò)程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。

? ⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液

　 Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來(lái)越多，有超過(guò)磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。

? Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：

? ? ? Tris-HCl緩沖液：? pH＝7.5～8.5

? ? ? Tris-磷酸鹽緩沖液： pH＝5.0～9.0

? 配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書(shū)后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱(chēng)12.11g Tris堿溶于950mL～970mL 無(wú)離子水中，邊攪拌邊滴加4N HCl，用pH計(jì)測(cè)定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到1L。

? Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： ①因?yàn)門(mén)ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。

其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，即：

△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃時(shí)緩沖液的pH＝8.4，則37℃時(shí)的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 ④此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

? ⑶ 有機(jī)酸緩沖液

? 這一類(lèi)緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。

? 甲酸～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)pKa值：pKa1＝3.10，?

pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二個(gè)pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。

? 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反應(yīng)過(guò)程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過(guò)渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類(lèi)緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時(shí)，不能用這類(lèi)緩沖液。

? ⑷ 硼酸鹽緩沖液

? 常用的有效pH范圍是：pH＝8.5～10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類(lèi)的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。

? ⑸ 氨基酸緩沖液

? 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：

? 甘氨酸—HCl緩沖液：pH=2.0～5.0，

? 甘氨酸—NaOH緩沖液：pH=8.0～11.0，　 　 　? ?

　 甘氨酸—Tris緩沖液：pH=8.0～11.0，（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液），

? 組氨酸緩沖液：pH=5.5～6.5，

? 甘氨酰胺（glycine amide）緩沖液：pH=7.8～8.8，

? 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0～9.0。

? 此類(lèi)緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，如代謝過(guò)程等。②試劑的價(jià)格較高。

? ⑹ 兩性離子緩沖液（Zwitterionic buffers），又稱(chēng)Good’s緩沖液

1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來(lái)找到專(zhuān)門(mén)用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Good’s緩沖液可查閱有關(guān)的資料。

Good’s緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)等無(wú)抑制作用，所以它們專(zhuān)門(mén)用于細(xì)胞器和極易變性的、對(duì)pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點(diǎn)是：①價(jià)格昂貴，②對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使空白管的顏色加深。?

3 pH值的測(cè)定

? 測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法，最簡(jiǎn)便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1～14、9～14等，只能粗略確定溶液的pH值。另一種是精密pH試紙，可以較精確地測(cè)定溶液的pH值，其變色范圍是2～3個(gè)pH單位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等許多種，可根據(jù)待測(cè)溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。測(cè)定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙（不可用手拿，以免污染試紙），用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對(duì)照，估讀出所測(cè)pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。也可將試紙塊放在白色點(diǎn)滴板上觀察和估測(cè)。試紙要存放在有蓋的容器中，以免受到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各種氣體的污染。

? 精確測(cè)定溶液pH值要使用pH計(jì)，其精確度可達(dá)0.005pH單位，關(guān)鍵是要正確選用和校對(duì)pH電極。過(guò)去是使用兩個(gè)電極，即玻璃電極和參比電極（甘汞或銀—氯化銀電極），現(xiàn)在它們已淘汰，被兩種電極合一的復(fù)合電極所代替。

? 玻璃電極對(duì)溶液中的氫離子濃度敏感，其頭部為一薄玻璃泡，內(nèi)裝有0.1N HCl，上部由銀～氯化銀電極與鉑金絲聯(lián)結(jié)。當(dāng)玻璃電極浸入樣品溶液時(shí)，薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)的電位差取決于溶液的pH，即玻璃電極的電極電位隨樣品溶液中氫離子濃度（活度）的變化而變化。

? 參比電極的功能是提供一個(gè)恒定的電位，作為測(cè)量玻璃電極薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)電位差的參照。常用的參比電極是甘汞電極（Hg/HgCl）或銀—氯化銀電極（Ag/AgCl）。參比電極電位是氯離子濃度的函數(shù)，因而電極內(nèi)充以4M KCl或飽和KCl，以保持恒定的氯離子濃度和恒定的電極電位。使用飽和KCl是為使電極內(nèi)沉積有部分KCl結(jié)晶，以使KCl的飽和濃度不受溫度和濕度的影響。

? 現(xiàn)在pH測(cè)定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復(fù)合電極，即將它們共同組裝在一根玻璃管或塑料管內(nèi)，下端玻璃泡處有保護(hù)罩，使用十分方便，尤其是便于測(cè)定少量液體的pH值。? ?

(A) 玻璃電極? ? ? ?( 復(fù)合電極? ?(C) 參比電極（銀－氯化銀電極）

? ? ? ? ? ?圖3? pH電極示意圖

? ?測(cè)定pH值時(shí)，玻璃電極和參比電極同時(shí)浸入溶液中，構(gòu)成一個(gè)“全電池”，如下圖所示：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?pH計(jì)?

? ? ? Ag/AgCl? HCl( 0.1mol/L)? 樣品? 4mol/L KCl或? Ag/AgCl或

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 溶液? 飽和KCl? ? Hg/HgCl? ? ? ? ? ? ??

? ? ? ? ? ?玻璃電極? ? ? ? ? ?參比電極??

使用時(shí)應(yīng)注意：

? ?⑴經(jīng)常檢查電極內(nèi)的4mol/L KCl溶液的液面，如液面過(guò)低則應(yīng)補(bǔ)充4mol/L KCl溶液。

? ?⑵玻璃泡極易破碎，使用時(shí)必須極為小心。

? ?⑶復(fù)合電極長(zhǎng)期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平時(shí)可浸泡在無(wú)離子水或緩沖溶液中，使用時(shí)取出，用洗并沖洗玻璃泡部分，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待測(cè)溶液中，稍加攪拌，讀數(shù)時(shí)電極應(yīng)靜止不動(dòng)，以免數(shù)字跳動(dòng)不穩(wěn)定?！?　 　? 　?

? ?⑷使用時(shí)復(fù)合電極的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。

? ?⑸使用前要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正電極，其數(shù)據(jù)見(jiàn)書(shū)后附錄，常用的三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液是pH=4.00、6.88和9.23（20℃），精度為±0.002pH單位。校正時(shí)先將電極放入6.88的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用pH計(jì)上的“標(biāo)準(zhǔn)”旋鈕校正pH讀數(shù)，然后取出電極洗凈，再放入4.00或9.23的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用“斜率”旋鈕校正pH讀數(shù)，如此反復(fù)多次，直至二點(diǎn)校正正確，再用第三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液檢查。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液不用時(shí)應(yīng)冷藏。

? ?⑹電極的玻璃泡容易被污染。若測(cè)定濃蛋白質(zhì)溶液的pH值時(shí)，玻璃泡表面會(huì)覆蓋一層蛋白質(zhì)膜，不易洗凈而干擾測(cè)定，此時(shí)可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡過(guò)夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若電極保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，校正數(shù)值不準(zhǔn)時(shí)，可將電極放入2mol/L KCl 溶液中，40℃加熱一小時(shí)以上，進(jìn)行電極活化。

? pH測(cè)定時(shí)會(huì)有幾方面的誤差：

? ⑴鈉離子的干擾：多數(shù)復(fù)合電極對(duì) Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的堿性溶液，Na+ 的干擾更加明顯。例如，當(dāng)Na+ 濃度為0.1mol/L時(shí)，可使pH值偏低0.4～0.5單位。為減少Na+ 對(duì)pH測(cè)定的干擾，每個(gè)復(fù)合電極都應(yīng)附有一條校正Na+干擾的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有的新式的復(fù)合電極具有Na+ 不透過(guò)性能，如無(wú)以上兩個(gè)條件，則可以將電極內(nèi)的KCl換成NaCl。

? ⑵濃度效應(yīng)： 溶液的pH值與溶液中緩沖離子濃度和其他鹽離子濃度有關(guān)，因?yàn)槿芤簆H值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相等。生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常配制比使用濃度高十倍的“貯液”，使用時(shí)再稀釋到所需濃度，由于濃度變化很大，溶液pH會(huì)有變化，因而稀釋后仍需對(duì)其pH進(jìn)行調(diào)整。

? ⑶溫度效應(yīng)：有的緩沖液的pH值受溫度影響很大，如“Tris”緩沖液，因而配制和使用都要在同一溫度下進(jìn)行。