?？葱≡乒娞柕姆劢z朋友們，應(yīng)該有發(fā)現(xiàn)小云會經(jīng)常分享一些國自然熱點(diǎn)，比如腫瘤免疫、細(xì)胞死亡、腫瘤代謝、表觀遺傳修飾等等~?~

（2022年國自然熱點(diǎn)方向，圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

但這么多國自然熱點(diǎn)中有一個(gè)聽起來好像跟生信完全不沾邊的方向小云還沒有推薦過，還經(jīng)常出現(xiàn)在CNS頂刊中，它就是“相分離”，那它怎么拿來做生信呢？在看思路之前，還是先跟小云初步了解下什么是相分離？（ps：追新熱點(diǎn)只要跟緊小云就可以啦，小云發(fā)現(xiàn)新方向會第一時(shí)間分享給粉絲朋友們的）

相分離 (phase separation)是將生物分子從均勻環(huán)境中分離成兩種不同的相(凝聚相和稀相)的密度依賴性分離。生活中可以見到水上漂浮的油滴，就是一種相分離現(xiàn)象。一共兩種相，即水和油，由于都是液體，也叫液液相分離（LLPS，liquid-liquid phase separation）。

Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)文章，提出了細(xì)胞內(nèi)通過“相分離”，可以提供一種特定的方式讓細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的”細(xì)胞內(nèi)部形成一定“秩序”。相分離參與無膜器官的形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、超分子組裝、基因的激活。相分離異常可能導(dǎo)致疾病發(fā)生，比如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、衰老等。異常LLPS與癌癥的幾個(gè)特征廣泛相關(guān)，包括持續(xù)增殖信號、生長抑制逃避、細(xì)胞死亡抵抗、端粒維持和DNA損傷修復(fù)。

大概了解了“相分離”與疾病的關(guān)系，那它又該怎么切入做生信呢？其實(shí)非常簡單，在常規(guī)套路上，只需要換個(gè)“相分離基因集”就可以啦，還有專門的數(shù)據(jù)庫PhaSepDB、DrLLPS，相當(dāng)方便了！今天小云就分享一個(gè)6分+的干濕結(jié)合思路給小伙伴們打個(gè)樣，文章做了腫瘤預(yù)后+分型分析+驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，創(chuàng)新性到位，數(shù)據(jù)也很豐富，值得一學(xué)！目前“相分離”做生信的還很少，小云已備好基因集，感興趣的朋友抓緊行動(dòng)，換個(gè)癌種去復(fù)現(xiàn)吧！

l?題目：一個(gè)與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)和腫瘤免疫環(huán)境相關(guān)液-液相分離相關(guān)指數(shù)

l?雜志：Int J Mol Sci.

l?影響因子：IF=6.208

l?發(fā)表時(shí)間：2023年3月

研究背景

生化復(fù)發(fā)(BCR)是一個(gè)表明前列腺癌(PCa)患者的預(yù)后不良的指標(biāo)，然而，很少有公認(rèn)的目標(biāo)可以有助于預(yù)測前列腺癌患者的BCRFS。已有研究報(bào)道了液-液相分離（LLPS）在前列腺癌治療和進(jìn)展中的重要性，但集中探討LLPS與PCa患者BCR之間相關(guān)性的研究仍然有限。

數(shù)據(jù)來源

研究思路

首先篩選了差異表達(dá)的液-液相分離相關(guān)基因(DELRGs)，然后通過共識聚類分析確定了PCa的三個(gè)LLPS相關(guān)分子簇，并進(jìn)行亞型間的預(yù)后分析和免疫浸潤分析。再通過LASSO cox回歸分析建立一個(gè)新的LLPS相關(guān)指數(shù)來預(yù)測生化復(fù)發(fā)(BCR)無瘤生存率(BCRFS)。隨后探索了LLPS相關(guān)指數(shù)與分子亞型、腫瘤免疫微環(huán)境和藥物敏感性的潛在相關(guān)性。最后，進(jìn)行了關(guān)鍵基因FUS的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以驗(yàn)證FUS是PCa的潛在生物標(biāo)志物。

主要結(jié)果

1. 基于液-液相分離的腫瘤分型分析

首先在TCGA隊(duì)列中篩選獲得了102個(gè)差異表達(dá)的液-液相分離相關(guān)基因(DELRGs)（圖1A），隨后進(jìn)行了單變量Cox回歸分析以篩選與無BCR生存率(BCRFS)相關(guān)的預(yù)后性DELRGs?；谶@些基因進(jìn)行一致性聚類分析，獲得了3個(gè)基于LLPS的分子簇（圖1B）。通過KM生存分析比較3個(gè)亞型間的預(yù)后差異（圖1D），并比較3個(gè)亞型間的PD-1和PD-L1表達(dá)差異（圖1E）。然后使用估計(jì)算法和CIBERSORT算法，分析不同LLPS相關(guān)分子簇間免疫浸潤細(xì)胞（圖2A）和腫瘤微環(huán)境評分的差異（圖2B）。（ps：差異基因分析、cox回歸分析、聚類分析、KM曲線繪制也可以用小云新開發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。?

圖1 基于液-液相分離的腫瘤分型分析

圖2亞型間腫瘤微環(huán)境分析

2. 一種新的LLPS指數(shù)的開發(fā)和驗(yàn)證

首先在TCGA隊(duì)列中進(jìn)行單變量Cox分析，篩選得到13個(gè)BCR預(yù)后相關(guān)DELRGs（圖3C）。然后再利用LASSO回歸分析最終篩選出6個(gè)DELRGs，并構(gòu)建了一個(gè)新的與LLPS相關(guān)的預(yù)后指數(shù)來預(yù)測前列腺癌患者的BCRFS（圖3D, E）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)，將所有病例分為兩個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)評分亞組，進(jìn)行KM生存分析并通過ROC曲線來評估其預(yù)測性能（圖3A, B）。

圖3 LLPS指數(shù)的開發(fā)和驗(yàn)證

3. 風(fēng)險(xiǎn)評分與臨床病理特征、腫瘤干細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性分析

通過單變量和多變量回歸進(jìn)行獨(dú)立預(yù)后分析，結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評分是PCa患者的獨(dú)立預(yù)測因子（圖4A, B）。隨后分析了風(fēng)險(xiǎn)評分與一些臨床病理特征（圖4C）和干細(xì)胞評分的相關(guān)性（圖4D, E）。利用ssGSEA分析來量化免疫功能，評估不同風(fēng)險(xiǎn)亞組間的免疫浸潤情況（圖4F）。（ps：多種免疫浸潤分析也可以用云生信平臺分析工具實(shí)現(xiàn)哦，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html，歡迎朋友們來探索~?~）

圖4?風(fēng)險(xiǎn)評分與臨床病理特征、腫瘤干細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性分析

4. 關(guān)鍵基因表達(dá)和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

作者通過qRT-PCR檢測前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中6個(gè)模型基因的mRNA表達(dá)水平（圖5A），通過IHC染色來分析這些6個(gè)基因在前列腺增生和前列腺癌組織中蛋白表達(dá)的差異（圖5B）。根據(jù)結(jié)果選擇關(guān)鍵基因FUS作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，沉默其表達(dá)后，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖（圖5C），Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲（圖5E-H），流式檢測細(xì)胞凋亡（圖5I, K），結(jié)果顯示，沉默FUS可以減少前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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圖5 關(guān)鍵基因表達(dá)和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

小結(jié)

這篇文章選擇“相分離”這一高創(chuàng)新性方向，進(jìn)行簡單的預(yù)后模型構(gòu)建和分型分析，再聯(lián)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，拿下6分+的文章還是很輕松的！并且目前“相分離”方向的生信文章比較少，發(fā)文空間是相當(dāng)大的，想做搶占發(fā)文紅利期的小伙伴趕快來抄作業(yè)，用上小云備好的基因集去復(fù)現(xiàn)吧，文章在向你招手啦！