上期介紹了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的過程和關(guān)鍵受體，本期將主要介紹觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的因素及檢測方法。

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觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的因素

營養(yǎng)缺乏、細胞應(yīng)激以及其他一些重要信號包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的恢復(fù)、錯誤折疊多肽的積累、核糖體的停滯等均會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

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營養(yǎng)缺乏

營養(yǎng)缺乏的情況下，細胞會激活自噬程序，其中部分細胞質(zhì)內(nèi)容物在溶酶體/液泡內(nèi)降解為基本代謝物，從而形成內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)庫。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體，如FAM134、RTN3L、TEX264等都是在細胞處于營養(yǎng)缺乏的條件下發(fā)現(xiàn)的。

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細胞應(yīng)激

細胞穩(wěn)態(tài)受到干擾會激活一組稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的翻譯后修飾，從而觸發(fā)下游信號特異性轉(zhuǎn)錄和翻譯程序，最終會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大小、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白質(zhì)水平及整體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性。如果干擾持續(xù)存在，則會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，以防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度擴增，從而避免細胞凋亡。

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其他重要信號

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從應(yīng)激中恢復(fù)、錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累、核糖體的停滯和病原體入侵都會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

藥物治療通過擾動鈣或氧化還原穩(wěn)態(tài)而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大小增加[1]。藥物治療中斷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從應(yīng)激中恢復(fù)，多余的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會被遞送至溶酶體中降解，這一類型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受SEC62蛋白的調(diào)節(jié)[2]。

錯誤折疊的蛋白對細胞有毒性，通過統(tǒng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ER-associated degradation，ERAD）的分解代謝過程被細胞質(zhì)蛋白酶體降解（圖1）。未能進入ERAD系統(tǒng)的錯誤折疊多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐分子伴侶的干預(yù)下被分離到專門的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)子結(jié)構(gòu)域，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子又與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體結(jié)合。這激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬反應(yīng)，促進這部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡化及隨后的溶酶體降解。這些過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-溶酶體相關(guān)降解（ER-to-lysosome-associated degradation，ERLAD）（圖2）[3]。

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新合成的蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當核糖體停留在有缺陷的mRNA上時，轉(zhuǎn)座子被阻斷功能失調(diào)，進而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬反應(yīng)[5]。

病原體如胞內(nèi)革蘭氏陽性菌入侵，其釋放的環(huán)狀二磷酸腺苷激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白STING，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬被激活，從而阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡[6]。

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的檢測方法

為闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的分子機制、生理和病理作用以及尋找調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的藥物，監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬活性十分重要。

透射電子顯微鏡可以觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，但無法衡量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬活性。一些內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（如RTN1、RTN3、RTN4、REEP5、CLIMP63和Trap-α）在自噬中表達水平下降，但變化通常很小。相比之下，饑餓誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體蛋白（如CCPG1和TEX264）的降解更明顯，但它們是選擇性降解的，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬過程中也可能被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄表達，不能準確反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平。因此熒光標記的報告載體是自噬研究最常用的手段，基于此漢恒生物推出了以下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測工具（表1）。

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通過將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列與RFP-GFP熒光串聯(lián)序列融合表達來構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬報告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL（ss：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽序列，ER signal sequence；KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列）（圖3A）和mCherry-EGFP-RAMP4（RAMP4：即SERP1基因，Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1，可以特異性定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上）（圖3B）。在細胞質(zhì)中，紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白同時表達，表現(xiàn)為黃色；若發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，由于溶酶體偏酸性的環(huán)境，綠色熒光蛋白淬滅，只剩下紅色熒光信號。此外，在溶酶體中，報告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL中的mRFP1與EGFP間的linker會被剪切，因此也可通過Western Blot結(jié)果統(tǒng)計mRFP1/mRFP1-EGFP比值來指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

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除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬外，漢恒生物還可提供監(jiān)測高爾基體自噬和溶酶體自噬，以及定位各個細胞器的工具病毒，若有細胞器自噬相關(guān)的技術(shù)問題，歡迎咨詢漢恒生物！

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參考文獻：

[1]?Bolender, R P., Weibel, E R.. A morphometric study of the removal of phenobarbital-induced membranes from hepatocytes after cessation of threatment. The Journal of cell biology, 1973, 56(3):746-61.

[2]?Linxweiler, Maximilian., Schick, Bernhard., Zimmermann, Richard.. Let's talk about Secs: Sec61, Sec62 and Sec63 in signal transduction, oncology and personalized medicine. Signal transduction and targeted therapy, 2017, 2:17002.

[3]?Wilkinson, Simon.. ER-phagy: shaping up and destressing the endoplasmic reticulum. The FEBS journal, 2019, 286(14):2645-2663.

[4]?Reggiori, Fulvio., Molinari, Maurizio., Molinari, Maurizio.. ER-phagy: mechanisms, regulation, and diseases connected to the lysosomal clearance of the endoplasmic reticulum. Physiological reviews, 2022, .

[5]?Liang, Jin Rui., Lingeman, Emily., Luong, Thao., Ahmed, Saba., Muhar, Matthias.. A Genome-wide ER-phagy Screen Highlights Key Roles of Mitochondrial Metabolism and ER-Resident UFMylation. Cell, 2020, 180(6):1160-1177.e20.

[6]?Moretti, Julien., Roy, Soumit., Bozec, Dominique., Martinez, Jennifer., Chapman, Jessica R.. ?STING Senses Microbial Viability to Orchestrate Stress-Mediated Autophagy of the Endoplasmic Reticulum. Cell, 2017, 171(4):809-823.e13.