|??可變剪接與臨床致病?

pre-mRNA剪接是真核生物基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，其剪接異常會引起基因表達(dá)量異常、蛋白質(zhì)功能改變，是疾病發(fā)生的常見原因。?

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，大量的潛在致病變異被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)報道，大約1/3的致病變異會導(dǎo)致pre-mRNA剪接異常，常見的為：整個外顯子缺失、部分外顯子缺失、整個內(nèi)含子保留（即內(nèi)含子變?yōu)橥怙@子）、部分內(nèi)含子保留（即剪接發(fā)生在內(nèi)含子上其他符合splice site特征的位點(diǎn)）、多個外顯子缺失等。而這些異常剪接的結(jié)果是蛋白質(zhì)缺失一段氨基酸或者更為常見的翻譯提前終止。

|??目前大部分致病變異的臨床意義未知

臨床上DNA測序檢測出堿基突變，懷疑變異位點(diǎn)影響pre-mRNA的剪切，從而影響基因功能，但是卻沒有樣本來進(jìn)行驗(yàn)證怎么辦？Minigene技術(shù)可以解決這個問題。?

Minigene splicing assay，是一項(xiàng)針對突變位點(diǎn)是否影響mRNA剪接的細(xì)胞水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)通過將帶有變異基因的外顯子和內(nèi)含子片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用RT-PCR及Sanger測序檢測異常mRNA產(chǎn)物，進(jìn)而分析基因變異對pre-mRNA可變剪接的影響（如內(nèi)含子滯留和外顯子切除）。

|??Minigene splicing assay的技術(shù)服務(wù)和流程

·? 項(xiàng)目周期：6-9周

?·? 客戶提供：攜帶檢測突變的DNA樣本和正常DNA樣本
?·? 結(jié)果交付：

?（1）構(gòu)建的載體

?（2）實(shí)驗(yàn)報告：包括實(shí)驗(yàn)步驟，引物序列，測序峰圖，結(jié)果圖片和分析結(jié)果

|?Minigene splicing assay應(yīng)用案例介紹

Minigene技術(shù)驗(yàn)證魚鱗病綜合征SPINK5基因突變導(dǎo)致剪接異常

?SPINK5基因，c.891C>T變異，造成剪接異常，導(dǎo)致11號外顯子（SPINK5 Ex11）被切除，生成異常蛋白，引起危及生命的魚鱗病綜合征（Netherton syndrome）。

|?知識延伸?

|?剪切識別元件

突變之所以影響pre-mRNA剪切，是因?yàn)榛蛟趦?nèi)含子和外顯子中均包含各種順式作用元件，這是pre-mRNA正確、有效的拼接所必需的。順式元件主要包括：5'和 3’剪接位點(diǎn)、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子（ISE）、內(nèi)含子剪接沉默子（ISS）、外顯子剪接增強(qiáng)子 (ESE) 、 外顯子剪接沉默子 (ESS)。這些元件的突變就可能造成異常剪接，而最常見的是在外顯子-內(nèi)含子接頭處位點(diǎn)的突變，如5'和3’ splice site的突變（內(nèi)含子兩端為AG-exon-GT保守序列）。

|?Minigene reporter——基于Minigene技術(shù)的表型篩選方法

基于Minigene reporter技術(shù)的表型篩選方法，為攻克異常剪接引起的疾病的治療提供了重要的方法，通過表型篩選得到理想的化合物后，再利用相關(guān)技術(shù)確認(rèn)作用靶點(diǎn)，此類策略是開發(fā)First in class藥物非常有效的方法。Novartis就曾采用過這個技術(shù)來篩選治療SMA（脊髓型肌萎縮）的小分子化合物。SMA（脊髓型肌萎縮）是一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病，常見于嬰幼兒，主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌張力低、腱反射減弱等，大部分患兒在不到兩周歲時死亡。其中一個發(fā)病原因是：SMN2基因中的一個堿基異位突變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄的mRNA前體在剪接時容易丟失7號外顯子，因此只能產(chǎn)生10%-20%的正常SMN蛋白，造成SMA。這是典型的mRNA前體剪接異常造成的關(guān)鍵蛋白表達(dá)障礙。

Novartis通過Minigene reporter技術(shù)，對大約1.4ⅹ106個化合物進(jìn)行篩選，得到了可以穩(wěn)定SMN2 pre-mRNA和U1 snRNP（剪接體的關(guān)鍵組成部分）結(jié)構(gòu)的小分子化合物，進(jìn)而提高了SMN2 mRNA正確剪接的比例。?

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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