一、百螢 ApoSight綠色胱天蛋白酶3/7底物工作原理

ApoSight 綠色半胱天冬酶3/7底物是個(gè)直接檢測(cè)活細(xì)胞中半胱天冬酶活性的熒光探針。它由三個(gè)部分組成，包括a）熒光團(tuán)，b）半胱天冬酶選擇性肽片段（DEVD），以及c）細(xì)胞穿透部分。細(xì)胞穿透部分將探針帶入活細(xì)胞。進(jìn)入活細(xì)胞后，半胱天冬酶選擇性肽片段被半胱天冬酶裂解以釋放熒光團(tuán)。恢復(fù)的熒光強(qiáng)度直接與要檢測(cè)的胱天蛋白酶3/7的活性有關(guān)。與活細(xì)胞中現(xiàn)有的半胱天冬酶測(cè)定相比，ApoSight Green Caspase 3/7底物更加穩(wěn)定，方便和準(zhǔn)確。 ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物釋放出Ex / Em?490/520 nm的熒光團(tuán)。如NucView試劑所報(bào)道的，它不需要DNA相互作用就能發(fā)熒光。如FMK肽探針?biāo)鶊?bào)道的，它不抑制胱天蛋白酶活性。盡管胱天蛋白酶的熒光FMK肽抑制劑被廣泛用于檢測(cè)活細(xì)胞中的胱天蛋白酶活性，但該技術(shù)有一些嚴(yán)重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制劑具有很高的細(xì)胞毒性，因?yàn)镕MK肽與活性胱天蛋白酶共價(jià)結(jié)合。 b）FMK肽與caspase的不可逆共價(jià)結(jié)合會(huì)抑制caspase活性，導(dǎo)致假陽(yáng)性凋亡。 C） FMK分析具有極高的背景，并且需要大量洗滌，從而導(dǎo)低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不穩(wěn)定，必須立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并易于適應(yīng)自動(dòng)化。

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?二、百螢 ApoSight綠色胱天蛋白酶3/7底物參數(shù)

Ex(nm)? ? ? ?500

Em(nm) ?????522

分 子 量 ?????1290.61

溶? ? ??劑 ?????DMSO

存儲(chǔ)條件? ? ?在-15℃以下保存，避光防潮

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三、百螢 ApoSight綠色胱天蛋白酶3/7底物實(shí)驗(yàn)方案

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簡(jiǎn)要概述

1.使用96孔板的密度為5×104至2×105細(xì)胞/ 100 μL /孔的待測(cè)化合物制備細(xì)胞
2.加入等體積的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育60分鐘
4.用HHBS洗滌細(xì)胞1-2次
5.使用帶有530/30 nm濾波片（FITC通道）的流式細(xì)胞儀或帶有FITC濾波片組的熒光顯微鏡分析細(xì)胞

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。

ApoSight Green Caspase 3/7底物儲(chǔ)備液（200X）
在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

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2.工作溶液配置

ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液

在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。