產(chǎn)品介紹

Frdbio? Fluor熒光染料為活性熒光染料，該系列包括從紫外、可見光譜到近紅外光譜常見熒光染料，用于標(biāo)記生物分子，特別是蛋白質(zhì)和核酸。對(duì)核心結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新性修改使得Frdbio? Fluor染料優(yōu)于具有許多創(chuàng)新新穎特征的其他商業(yè)染料，主要表現(xiàn)在標(biāo)記效率更高，發(fā)光度更強(qiáng)。

Frdbio?Fluor647是一種遠(yuǎn)紅外熒光染料，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為650nm和665nm，是Cy5、Alexa For 647的超級(jí)替代物。它與抗體形成更特異的抗體熒光素結(jié)合物，背景較更低。

基本原理

本試劑盒主要通過熒光素集團(tuán)的活性鍵與生物分子的游離氨基共價(jià)結(jié)合，可以用于標(biāo)記抗體，蛋白。本試劑盒種所提供的熒光染料都為預(yù)先活化干粉，便于長期保存，使用時(shí)用試劑盒隨帶的DMSO溶解便可直接用于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，60-90分鐘可以輕松完成標(biāo)記。標(biāo)記產(chǎn)物在含有防腐劑的保存液中可以放置在?4?C至少保存1個(gè)月以上，需要長期保存。

本試劑盒常被用于抗體的直接標(biāo)記，省卻了二抗的使用和其所帶來的操作步驟。

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試劑盒組分

組分名稱（Components）

型號(hào)規(guī)格及其對(duì)應(yīng)組分

ARL0560K-200

ARL0560K-500

ARL0560K-1000

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其他規(guī)格可洽定制

可標(biāo)記抗體量

0.2~1.0mg

0.5~2.5mg

1.0~5.0mg

活化Fluor647干粉

使用時(shí)加DMSO ? 40ul溶解

使用時(shí)加DMSO ? 100ul溶解

使用時(shí)加DMSO ? 200ul溶解

DMSO

40ul

100ul

200ul

標(biāo)記緩沖液(Coupling buffer)

10mL

15mL

30mL

標(biāo)記物保存液(Preservation?Buffer)

2.0mL

2mL*2

10mL

純化超濾管:????????????????????????????????????????????? ?

1支

1支

1支

重要提示：

1.????本試劑盒所配置的活化Fluor647熒光染料為干粉，可放置4?C或者-20?C長期保存，使用時(shí)加入試劑盒所配的DMSO溶解即可用于標(biāo)記，溶解后的Fluor647熒光染料不可保存下次使用，建議一次性使用完；

2.????本試劑盒所配置的超濾管默認(rèn)截留30k MWCO,適合于抗體抗體，如果需要標(biāo)記其他分子量蛋白類物質(zhì)請(qǐng)與我們聯(lián)系，給您配置相應(yīng)分子量截留超濾管（您的待標(biāo)記物質(zhì)分子量必須大于超濾管截留分子量的2倍以上）；

3.????本試劑盒所推薦的抗體標(biāo)記量僅供參考，如有更高要求需要實(shí)驗(yàn)者具體摸索優(yōu)化，建議按照推薦最低量進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

4.????對(duì)待標(biāo)記抗體、蛋白質(zhì)的要求：

ü??待標(biāo)記物以0.01M pH7.4 PBS環(huán)境為佳，不應(yīng)含有甘油、BSA、疊氮鈉、氨基物質(zhì)（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物質(zhì)。如果含有以上小分子物質(zhì)，需用0.01M pH7.4 PBS 緩沖溶液進(jìn)行充分透析、脫鹽柱脫鹽或者超濾管超濾置換溶液以除去干擾小分子，如果含有保護(hù)性蛋白BSA等需要想辦法將其分離去除；

ü??調(diào)整待標(biāo)記物至適當(dāng)?shù)臐舛?，抗體調(diào)整的濃度為2-10mg/mL為宜；對(duì)于小分子物質(zhì)需要實(shí)驗(yàn)者摸索濃度，保證熒光素的比例過量。

ü??最佳標(biāo)記反應(yīng)條件為試劑盒所提供的標(biāo)記緩沖液環(huán)境，盡可能在標(biāo)記前將待標(biāo)記物溶液環(huán)境置換為標(biāo)記還緩沖液；

ü??如果待標(biāo)記物溶液中有不溶物、有塊狀物或者沉淀請(qǐng)離心或者過濾除掉。

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其他需要自備材料：

ü??待標(biāo)記的生物分子

ü??移液器及吸頭.

ü??去離子水.

ü??PBS (pH 7.4)

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試劑盒儲(chǔ)存

試劑盒放在-20?C可保存6個(gè)月以上。.

試劑盒使用操作流程

???試劑準(zhǔn)備

待標(biāo)記的生物分子與熒光素最佳摩爾比例為1:8-1:22,本試劑盒推薦最佳比例為1:15（按照本試劑盒操作熒光素干粉加入相應(yīng)量DMSO溶解后的熒光素濃度770uM(770nmol/ml),通常1mg/ml抗體(分子量150kDa)的濃度為6.67uM(6.67nmol/ml)；?為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。以抗體標(biāo)記為例，推薦量如下。最佳標(biāo)記體系應(yīng)保證抗體的濃度為2mg/ml，標(biāo)記時(shí)終濃度不低于1mg/ml。對(duì)于其他標(biāo)記量，參照表按等比例調(diào)整抗體的體積和用量。

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???樣品準(zhǔn)備

待標(biāo)記的分子濃度不低于2 mg/ml，如果濃度較低，需在實(shí)驗(yàn)之前濃縮到2mg/ml以上；待標(biāo)記的分子需要溶解在符合以下要求的緩沖液中，如果符合以下要求可以直接進(jìn)行標(biāo)記，如果不符合請(qǐng)將溶液置換（透析或者超濾）到符合要求的溶液中在進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

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pH

6.5-8.0

不含游離氨基

MES, PBS, HEPES

螯合劑 (e.g. EDTA)

ü

甘油

< 5%

牛血清白蛋白

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甘氨酸

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含氨基組分

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???操作流程(以標(biāo)記100ug抗體為例,2mg/ml)

1)???將待標(biāo)記抗體溶液置換成標(biāo)記緩沖液，或者加入1/10體積標(biāo)記緩沖液，用移液器輕輕混勻；

2)???取20ul(按照抗體與熒光素摩爾比=1:23)活化的Fluor647溶液加入到上述步驟混勻的抗體中，輕輕混勻，37℃ 避光反應(yīng)1小時(shí)；

3)???反應(yīng)完畢，將適量的PBS（約450uL）加入到步驟2)的混合溶液中，輕輕混勻并將溶液移至超濾管芯，4℃ 12000離心5min；

4)???離心完畢，取出管芯將外套管內(nèi)溶液棄掉，管芯重新插入外套管，在管芯內(nèi)重新加入適量的PBS（約450uL）4℃ 12000離心5min；

5)???重復(fù)步驟4）5次以上；

6)???將超濾管芯內(nèi)溶液輕輕混勻并吹打管心內(nèi)壁，并轉(zhuǎn)移到干凈避光離心管，此即為熒光素標(biāo)記產(chǎn)物。

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???標(biāo)記產(chǎn)物的保存

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整到合適的濃度，可加入適量BSA，甘油及防腐劑等，分裝成小分-20℃避光保存；也可以將試劑盒附帶的標(biāo)記物保存液與標(biāo)記產(chǎn)物按照體積比1：1混勻后，即可分裝保存。

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?Flour 647標(biāo)記蛋白F/P值計(jì)算：

1）用PBS?精確倍數(shù)稀釋定量的少許純化過的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測(cè)定280nm和650nm的光吸收；

2）計(jì)算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A650×0.03))×稀釋倍數(shù)/203000

3）計(jì)算標(biāo)記比例：?每摩爾蛋白結(jié)合的染料摩爾數(shù)=A650×稀釋倍數(shù)/(239000×蛋白摩爾濃度)

常見問題及解決辦法

Q:?待標(biāo)記分子經(jīng)過濃縮濃度仍然達(dá)不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?

A:?標(biāo)記的時(shí)候盡可能達(dá)到這個(gè)濃度，如果實(shí)在達(dá)不到這個(gè)濃度，適當(dāng)增加加入的活化的熒光素的量；最佳標(biāo)記效果可以梯度增加熒光素用量試驗(yàn)測(cè)試來確定。

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Q:?待標(biāo)記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？

A:?這個(gè)要根據(jù)不同生物分子性質(zhì)確定，更準(zhǔn)確的說與生物分子表面氨基個(gè)數(shù)有關(guān)系；最佳標(biāo)記比例可根據(jù)梯度用量測(cè)試確定。

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Q:?如果選擇標(biāo)記試劑盒中的超濾管型號(hào)?

A:?一般來說，您待標(biāo)記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標(biāo)記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標(biāo)記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化

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Q:標(biāo)記效率低

A:有以下原因：

1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應(yīng)降低了標(biāo)記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標(biāo)記前用PBS透析。

? ? 2）蛋白含量較低?(≤1 mg/mL)會(huì)影響標(biāo)記效率。

3）標(biāo)記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應(yīng)混合物的pH升高至～8，因?yàn)樵谌鯄A性環(huán)境中標(biāo)記反應(yīng)的效率最高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調(diào)節(jié)至最適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1 M碳酸氫鈉透析等。

? ? ?4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標(biāo)記效率和標(biāo)記速度（只需10min）明顯改善。

5）不同抗體與熒光團(tuán)的反應(yīng)速率不同，染料標(biāo)記后保留的生物活性程度也不同，因此標(biāo)準(zhǔn)步驟也不是總有最好的標(biāo)記結(jié)果。為增加標(biāo)記率，可以對(duì)同一樣品進(jìn)行再標(biāo)記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標(biāo)記。有研究者在室溫孵育1小時(shí)后再4℃孵育過夜，情況有所改善。