?? RNAi技術(shù)瓶頸

目前，在基因干擾的方法中，應(yīng)用最廣泛的當(dāng)屬RNAi技術(shù)（siRNA or shRNA）了。對于研究者來說，暫時抑制或者下調(diào)基因功能，RNAi技術(shù)只需設(shè)計相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，操作簡便，性價比高。然而，這種技術(shù)有很多潛在的問題：

?常見的脫靶效應(yīng)你以為是你研究的基因，其實不是

如利用RNAi技術(shù)篩選的STK33基因作為癌細(xì)胞靶標(biāo)而最后被證明是烏龍事件，siRNA靶向的是脫靶后的其他基因而非STK33基因，此類事例數(shù)不勝數(shù)，因此，結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)，結(jié)果可能會更準(zhǔn)確。

目的蛋白表達(dá)水平下調(diào)不明顯

很多研究者在設(shè)計siRNA時，會多設(shè)計幾條siRNA序列，轉(zhuǎn)染后篩選最佳的siRNA，然而，即便這樣，可能目的基因和目的蛋白表達(dá)水平下調(diào)不明顯。除此以外，還有高轉(zhuǎn)化率的轉(zhuǎn)錄本和非編碼基因難以被干擾等，給研究造成了一定的困難。

?? CRISPR/Cas9技術(shù)的誕生

但是，科學(xué)總在不斷進步。2020年諾貝爾化學(xué)獎首次同時授予2名女性科學(xué)家。她們分別是基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的發(fā)明者：法國和美國科學(xué)家埃曼紐爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）。CRISPR/Cas9，是她的英文Clustered Regularly Short Palindromic Repeat的縮寫，這個成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列最初是在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)的，名字聽起來很高大上，但其實很簡單：它的本質(zhì)上就是在很多細(xì)菌基因組DNA上總會出現(xiàn)重復(fù)多次的DNA序列，重復(fù)序列之間夾雜著看似無序的序列，后來，結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，看似無序的序列和很多病毒基因組高度一致。進一步，研究者們發(fā)現(xiàn)，原來，細(xì)菌在面對病毒入侵以后，活下來的細(xì)菌會把病毒基因組的一部分DNA小心的儲存在這段精心設(shè)計的重復(fù)序列里面，當(dāng)下次面對同種病毒再次入侵時，細(xì)菌會快速識別病毒，并將病毒DNA剪切從而失去功能，阻止對細(xì)菌本身的傷害。不同于人類這種多細(xì)
胞生物本身存在多種免疫細(xì)胞，單細(xì)胞的細(xì)菌的免疫系統(tǒng)顯得簡潔優(yōu)美。

那么，細(xì)菌是如何發(fā)揮它的免疫功能，識別病毒的DNA序列呢？科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，CRISPR序列可以轉(zhuǎn)錄成RNA分子，并和細(xì)菌內(nèi)某種蛋白結(jié)合（Cas類蛋白），形成CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)（以Cas9蛋白為例），這類CRISPR/Cas每日在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)巡邏，尋找是否有和它完美匹配的DNA分子，顯然，能匹配的序列只能是入侵的病毒。一旦兩者相遇，病毒和Cas9蛋白上的RNA互補配對，被Cas9蛋白抓住，然后Cas9蛋白發(fā)揮相應(yīng)的核酸酶功能，剪斷病毒的DNA，使其失去功能。

這一段精彩的故事暫時看起來和基因編輯毫無關(guān)聯(lián)，但是，請思考一下，這套系統(tǒng)有一個巨大的作用：識別目標(biāo)序列并進行剪切。假如我們把細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的RNA換成可以和我們目的基因結(jié)合的RNA（sgRNA）呢？一方面，sgRNA可以和Cas9蛋白結(jié)合，另一方面，sgRNA可攜帶著Cas9蛋白精確找到靶基因，并對其進行一系列剪切，使此基因徹底失去功能。因此，新一代的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9誕生了。

?