引 言

合成信使RNA已在基于mRNA的治療及疫苗開發(fā)過程中成為了一種新興的應(yīng)用技術(shù)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circRNAs）能在細(xì)胞中具備良好的穩(wěn)定性和持久的蛋白表達(dá)能力，合成環(huán)狀RNA作為一種新型的mRNA合成技術(shù)顯現(xiàn)出來優(yōu)越的應(yīng)用潛能。然而，環(huán)狀RNA的翻譯控制仍具有挑戰(zhàn)性。

2023年1月，Nucleic Acids Research雜志上發(fā)表了一篇文章Synthetic circular RNA switches and circuits that control protein expression in mammalian cells。作者開發(fā)了“circRNA開關(guān)”，能夠通過感知細(xì)胞內(nèi)RNA或蛋白質(zhì)來控制circRNA的蛋白表達(dá)。其方法在于：將miRNA結(jié)合或蛋白結(jié)合序列分別插入非翻譯區(qū)(utr)或柯薩奇病毒B3內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(CVB3 IRES)，設(shè)計(jì)成了miRNA及蛋白響應(yīng)的環(huán)狀RNA翻譯開關(guān)，工程化的circRNA在不誘導(dǎo)嚴(yán)重細(xì)胞毒性和免疫原性的情況下有效表達(dá)蛋白，并對(duì)靶mirna或蛋白做出反應(yīng)，從而控制circRNA的翻譯水平。此外，作者還構(gòu)建了“基于circRNA的基因電路”，通過檢測(cè)內(nèi)源性miRNA及蛋白響應(yīng)的circRNA，從而選擇性地激活翻譯。本項(xiàng)研究為工程化RNA的設(shè)計(jì)提供了新的見解，并在RNA合成生物學(xué)和基因細(xì)胞治療領(lǐng)域具有廣泛的潛力。

01、circRNA的環(huán)化設(shè)計(jì)及測(cè)試

作者選擇經(jīng)過人工改造的內(nèi)含子-外顯子(PIE)自剪切環(huán)化系統(tǒng)。結(jié)果顯示，通過PIE系統(tǒng)可體外人工制備circRNA（圖1），制備的環(huán)狀RNA在不引起嚴(yán)重細(xì)胞毒性和免疫原性的情況下可高效表達(dá)靶蛋白（圖2）。

02、miRNA響應(yīng)的circRNA開關(guān)構(gòu)建及測(cè)試

作者設(shè)計(jì)了circRNA（在utr處含有完全互補(bǔ)的anti-miR序列），并通過共轉(zhuǎn)染各種miRNA模擬物對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。通過在CVB3 IRES序列(5，端)之前或egfp編碼序列(3，端)之后插入anti-miR，制備了4種不同的人類miRNA(hsa-miR-206，hsa-miR-302a-5p，hsa-miR-21-5p和hsa-miR339-5p)響應(yīng)的circRNA開關(guān)。轉(zhuǎn)染circRNA開關(guān)和相應(yīng)的miRNA模擬物24h后，通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分析circRNA的EGFP表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有設(shè)計(jì)的miRNA響應(yīng)性開關(guān)均通過感知靶miRNA模擬物來抑制EGFP表達(dá)（圖3A）。觀察到的ON狀態(tài)和OFF狀態(tài)之間的倍數(shù)變化(約2 ~ 38倍范圍)取決于靶miRNA、anti-miR插入位置和內(nèi)部polyA序列的存在與否（圖3B）。作者推測(cè)miR21-5p和miR-339-5p響應(yīng)開關(guān)的相對(duì)低倍數(shù)變化可能是由于HEK293FT細(xì)胞中內(nèi)源性miRNA活性介導(dǎo)的。因此，作者在細(xì)胞中添加靶向miRNA抑制劑來阻斷內(nèi)源性miRNA的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染miR-21-5p抑制劑可挽救circRNA翻譯；而miR-339-5p抑制劑未觀察到這一情況。這一結(jié)果表明，在miR-21-5p響應(yīng)開關(guān)的情況下，觀察到的低倍數(shù)變化是由于內(nèi)源性miR-21-5p活性弱化了ON狀態(tài)。此外，作者還研究了circRNA構(gòu)建體的開關(guān)是否可以檢測(cè)內(nèi)源性miRNA并調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的翻譯，重點(diǎn)關(guān)注HEK293FT中的hsa-miR-17-5p和HeLa和A549中的hsa-miR-21-5p，因?yàn)檫@些miRNA在每種細(xì)胞類型中都有效表達(dá)。結(jié)果表明，miRNA響應(yīng)的circRNA開關(guān)能有效地檢測(cè)靶miRNA，并控制其翻譯水平。

03、改造CVB3 IRES元件使其成為RBP響應(yīng)的circRNA開關(guān)

作者利用兩個(gè)RBP：MS2噬菌體外殼蛋白(MS2CP)和剪接體相關(guān)SNRPA(U1A)蛋白設(shè)計(jì)了蛋白質(zhì)響應(yīng)的circRNA。為了研究蛋白質(zhì)結(jié)合的部位能夠使IRES依賴的翻譯受到抑制，作者測(cè)試了4個(gè)CVB3 IRES變異體(變異體1-4)，這些變異體是通過插入蛋白結(jié)合基序(MS2SL和U1A適配子)設(shè)計(jì)的，同時(shí)參考了翻譯起始所需的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型（如圖4A）。插入MS2CP或U1A結(jié)合motif表明，只有將motif插入到結(jié)構(gòu)域VI (MS2CP)或VII (U1A)中的變異體4中，才能夠在靶RBP存在的情況下抑制翻譯，而其他變異體不能有效表達(dá)報(bào)告基因或?qū)Π蠷BP無應(yīng)答（如圖3B）。根據(jù)這些結(jié)果，可以預(yù)測(cè)翻譯起始因子eIF4G和eIF4A(與結(jié)構(gòu)域V-vii結(jié)合)的結(jié)合位點(diǎn)附近或下游的CVB3 IRES插入的motif，或針對(duì)18S rRNA的反義區(qū)域(結(jié)構(gòu)域V和VI之間的連接區(qū)域)，這是可能有效產(chǎn)生RBP響應(yīng)的circRNA開關(guān)（如圖4C）。為了優(yōu)化插入位置，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了變異體5和6，其插入motif位于結(jié)構(gòu)域VII莖環(huán)下游的20 nt或98 nt(僅位于ORF上游)，并比較了它們與變異體4的抑制效率。結(jié)果表明，存在MS2CP或U1A的情況下，MS2SL的變異體4和U1A的變異體5的翻譯抑制效果最好。作者應(yīng)用這些變異體來評(píng)估它們?cè)赾ircRNA中的表現(xiàn)，以確認(rèn)內(nèi)部polyA序列的存在或缺失對(duì)翻譯抑制和倍數(shù)變化的影響。如在存在或不存在MS2CP或U1A的情況下，在circRNA開關(guān)結(jié)構(gòu)中觀察到的翻譯抑制均有效。總之，這些結(jié)果表明，RBP響應(yīng)的circRNA開關(guān)可以通過CVB3 IRES的結(jié)構(gòu)域VI和VII區(qū)域來設(shè)計(jì)。

初稿：青梔

初審：劉弋

指導(dǎo)：山人

原文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac1252

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