「青蓮聚焦」優(yōu)化整合新策略-組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學的無偏性鑒定

? ? ? ?組氨酸磷酸化(pHis)是一種罕見的磷酸化修飾，在細菌與低等真核生物的信號轉(zhuǎn)導中起著關鍵作用，且已被證明參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展調(diào)控。與其他翻譯后修飾類似，識別pHis需要從復雜的生物樣本中富集磷酸化蛋白或pHis多肽，然后通過質(zhì)譜測序。然而由于其化學不穩(wěn)定性、亞化學計量特性與特異性富集試劑的缺乏，致使傳統(tǒng)的磷酸化蛋白質(zhì)組富集方法不適合探索pHis。

? ? ? ?近日，國家蛋白質(zhì)科學中心（北京）應萬濤課題組在分析化學專業(yè)雜志Analytical Chemistry在線發(fā)表題為“Integrated Strategy for Unbiased Profiling of the?Histidine Phosphoproteome”的文章，對于實現(xiàn)組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學的無偏性鑒定建立了一個整合策略。

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實驗流程

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實驗結果

1、強陽離子交換（SCX）色譜法可以區(qū)分pHis肽和His肽

? ? ? ?在pH值為2.7的弱酸性溶液中pHis肽的電荷狀態(tài)要低于His裸肽的電荷狀態(tài)，這為在蛋白質(zhì)組研究的進一步富集之前，通過利用強陽離子交換（SCX）色譜對pHis肽進行預富集奠定了理論基礎。作者利用α-酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)三種標準蛋白酶消化的肽混合物，建立了一個階梯梯度來實現(xiàn)不同電荷的肽的分離。

? ? ? ?結果表明，階梯式梯度實現(xiàn)了pHis肽和His肽的相對分離，在SCX分離過程中，pHis肽的磷酸基仍然保留。

?2、利用階梯SCX梯度從HeLa裂解物中鑒定pHis肽

? ? ? 作者從相同肽混合物的兩個相同的等分進行輕(甲醛、L)和重(C13D2O、H)標記。將重標肽酸化(pH<2.5)，在60°C下加熱2小時，以降低pHis水平，然后將兩組通過優(yōu)化的階梯梯度混合分離。分別收集2+和3+區(qū)域?qū)慕M分，進行酸處理。然后采用Cu-IDA技術對pHis肽選擇性富集，并用LC-MS/MS對這些多肽進行測序。

? ? ? ?觀察到F2（2+電荷區(qū)）和F3（3+電荷區(qū)）中約75%和0.87%的肽的凈電荷為2+，表明SCX色譜的選擇性有限。在F2和F3中共鑒定出414個肽，其中包括376個His和38個非His肽。結果發(fā)現(xiàn)，log2(F3/F2)在非His和pHis肽中的分布是不同的。根據(jù)作者的假設，預計F2和F3中的非His肽段具有相似的H/L比值，預期的log2(F3/F2)平均值為0。而pHis肽顯示出更高的值，表明這些肽可能被組氨酸磷酸化。在4個生物重復中，3組重標肽和一組輕標肽用酸處理（表示為反向標記重復序列）。作者認為pHis肽的低豐度可能夸大了數(shù)據(jù)依賴獲取的隨機性。一旦在一個重復的F2和F3中驗證了一個pHis肽，而在其他重復中驗證了一個候選肽，只要F2或F3的比例符合上述特征，它將被認為是潛在的pHis肽。共有310個獨特的潛在pHis肽，其中70.3%的pHis肽在至少兩次測試中被鑒定出來。作者觀察到，在正向和反向標記實驗中，NME2 (NIIHGSDSVK)，GAPDH (AGAHLQGGAK)和DDB1(LPSFELLHK)肽的H/L比值均有顯著差異。DDB1(LPSFELLHK)肽在4個生物學重復中通過抗pHis單克隆抗體富集方式在蛋白水平上被鑒定出來。

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3、利用線性SCX梯度提高對pHis肽的高可靠識別

? ? ? ?當處理含有多個堿性氨基酸的肽時，由于錯過缺失或存在多個組氨酸，階梯梯度有局限性。在這種情況下，pHis肽的凈電荷增加，保留時間會相應地向后移動。作者設計75min線性梯度，根據(jù)電荷的差異分離和去分離所有肽，優(yōu)化工作流程。

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? ? ? ?隨著鹽濃度的增加，已鑒定的His肽數(shù)量更多，與組氨酸吸收正電荷的增加預期一致。共鑒定出39519個肽，其中His肽22671個。最終結合兩個線性復制和階梯梯度結果，得到563個pHis肽(H=1)和249個pHis肽(H=2)，對應568個蛋白。為了確定具有兩個組氨酸殘基的多肽中修飾的特異性組氨酸，作者進行基序預測分析。結果表明pHis更傾向于疏水氨基酸，與之前的研究結果一致。作者提出的整合策略降低了數(shù)據(jù)庫搜索中pHis位點不匹配的概率，并提供了更準確的磷酸化位點分配，此方法可以作為組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組無偏覆蓋的有效策略。

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小結

? ? ? ?作者利用在pH 2.7的弱酸性溶液中pHis?肽相對于His裸肽的低電荷狀態(tài)，使用強陽離子交換(SCX)色譜法區(qū)分pHis肽和His裸肽。其次，采用Cu-IDA技術對pHis肽選擇性富集。最后，引入穩(wěn)定同位素二甲基標記技術，保證pHis肽的高可靠識別。利用該整合策略，從Hela細胞中鑒定到563條不同的pHis肽?(H = 1)?；蚍治霰砻鳎琾His肽具有一致的基序HxxK并偏好疏水氨基酸，覆蓋了以往幾種研究的結果。因此，該方法為揭示組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學和研究組氨酸磷酸化的生物學過程和功能提供了一個無偏而有效的工具。

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