2021 年 1 月，中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高華、魏敏杰教授和趙琳教授為共同通訊作者，在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (IF: 11.161) 雜志發(fā)表了題為“LncRNA CBR3-AS1 regulates of breast cancer drug sensitivity as a competing endogenous RNA through the JNK1/MEK4-mediated MAPK signal pathway”的研究論文，報道了 lncRNA CBR3-AS1 在乳腺癌耐藥中的分子機(jī)制。

中國醫(yī)科大學(xué)張明和王巖為共同第一作者，文章中?lncRNA 芯片實驗和分析由歐易生物協(xié)助完成。

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研究背景

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，阿霉素（ADR）被認(rèn)為是治療乳腺癌最有效的藥物之一。但在治療過程中，經(jīng)常出現(xiàn) ADR 耐藥性，并且其耐藥機(jī)制尚不清楚。lncRNA 參與了許多與腫瘤癌變和耐藥相關(guān)的生物學(xué)過程，但 lncRNA 在 ADR 耐藥過程中的作用尚待研究。

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研究內(nèi)容

本研究通過比較藥物敏感/抗性的乳腺癌細(xì)胞，鑒定到一個 lncRNA CBR3-AS1。CBR3-AS1 在乳腺癌組織中表達(dá)顯著升高，與預(yù)后不良密切相關(guān)。CBR3-AS1 過表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外的 ADR 耐藥。在機(jī)制上，CBR3-AS1 與 MAPK 通路的 MEK4 和 JNK1 競爭性結(jié)合 miR-25-3p，以 ceRNA 機(jī)制在乳腺癌化療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CBR3-AS1 有望作為乳腺癌靶向癌基因和治療性生物標(biāo)志物。

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研究結(jié)果

1.?CBR3-AS1 在耐藥乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)，并與藥物敏感性和預(yù)后不良相關(guān)

為了研究 lncRNA 在乳腺癌耐藥中的作用機(jī)制，利用 lncRNA 芯片，對耐藥性的 MCF-7/ADR 細(xì)胞進(jìn)行了檢測（圖 a-c）。從差異表達(dá)的 lncRNA 中挑選了 5 個之前未見報道的 lncRNA 進(jìn)行了 RT-PCR 驗證，其中 CBR3-AS1 表達(dá)量最高（圖 d），并且 CBR3-AS1 表達(dá)量與多種乳腺癌細(xì)胞的 ADR 抗性呈現(xiàn)正相關(guān)（圖 e-g）。同時，TCGA 數(shù)據(jù)分析顯示，CBR3-AS1 在乳腺癌組織中高表達(dá)（圖 h），并且 CBR3-AS1 高表達(dá)伴隨較差的臨床預(yù)后（圖 l-n）。

2.?CBR3-AS1 對乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的影響

為進(jìn)一步研究 CBR3-AS1 作用機(jī)制，在 MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá) CBR3-AS1。結(jié)果顯示，過表達(dá) CBR3-AS1 顯著降低了細(xì)胞中 ADR 的濃度（圖 c），并且細(xì)胞對藥物敏感性降低（圖 e），克隆形成能力增強(qiáng)（圖 g），細(xì)胞凋亡下降（圖 i）。而與之相反，在 MCF-7/ADR 細(xì)胞中 siRNA 干擾 CBR3-AS1，結(jié)果顯示細(xì)胞中 ADR 濃度上升（圖 d），藥物敏感性增強(qiáng)（圖 f），克隆形成能力降低（圖 h）。

3.?CBR3-AS1 通過?miR-25-3p 調(diào)控?MEK4/JNK1 表達(dá)

生物信息分析預(yù)測顯示，CBR3-AS1 可以結(jié)合多個 miRNAs，其中的 miR-25-3p 已報道與化療耐藥相關(guān)（圖 a）。RT-PCR 顯示 MCF-7/ADR 中 miR-25-3p 表達(dá)下調(diào)（圖 b）。利用 miRdb 預(yù)測和熒光素酶報告實驗顯示，miR-25-3p 可以直接靶向結(jié)合 MAPK 通路的 JNK1/MEK4（圖 d-e）。

RNA pulldown 實驗表明，CBR3-AS1 可以直接結(jié)合 miR-25-3p（圖 f-g）。RT-PCR 和 WB 實驗顯示，在 MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá) CBR3-AS1 可以顯著提高 JNK1 和 MEK4 的表達(dá)（圖 i-j），而 MCF-7/ADR 細(xì)胞中沉默 CBR3-AS1 則會下調(diào) JNK1 和 MEK4 的表達(dá)（圖 k-l）。

綜上所述，CBR3-AS1 可以通過 miR-25-3p 調(diào)控 MEK4/JNK1 的表達(dá)。

4.?沉默?JNK1 或過表達(dá)?miR-25-3p 可以恢復(fù)?ADR?藥物敏感性

進(jìn)一步實驗顯示，過表達(dá) miR-25-3p 或沉默 JNK1，可以逆轉(zhuǎn)由于 CBR3-AS1 過表達(dá)所引起的 ADR 藥物敏感性的降低（圖 a）、克隆形成能力的增強(qiáng)（圖 b）、細(xì)胞凋亡的下降（圖 c）。過表達(dá) miR-25-3p，可以逆轉(zhuǎn)由于 CBR3-AS1 過表達(dá)所引起的 JNK1/MEK4 的激活（圖 d-e）。

5.?CBR3-AS1 過表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞對?ADR?的耐藥

為進(jìn)一步在體內(nèi)驗證上述結(jié)論，將過表達(dá) CBR3-AS1 的 MCF-7 細(xì)胞接種到裸鼠。結(jié)果顯示，裸鼠體內(nèi)過表達(dá) CBR3-AS1 后，腫瘤組織內(nèi) miR-25-3p 表達(dá)量下降（圖 c），JNK1 和 MEK4 表達(dá)上升（圖 h-i）。過表達(dá) CBR3-AS1 可以抵抗 ADR 對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，而抑制 JNK1 可以逆轉(zhuǎn)這種抑制作用（圖 d）。JNK1 抑制同樣可以逆轉(zhuǎn) CBR3-AS1 對腫瘤大小和重量的促進(jìn)作用（圖 e-g）。以上結(jié)果表明，CBR3-AS1 可以在體內(nèi)通過 JNK1/MEK4 促進(jìn)乳腺癌 ADR 耐藥。

研究結(jié)論

本研究表明，CBR3-AS1 有望作為評價乳腺癌患者預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。CBR3-AS1 通過與 JNK1/MEK4 競爭性結(jié)合 miR-25-3p，激活 MAPK 信號通路，提高了乳腺癌對 ADR 的抗性。CBR3-AS1/miR-25-3p/JNK1/MEK4 軸為乳腺癌耐藥機(jī)制的深入研究提供了理論支持，為尋找新的乳腺癌診斷標(biāo)志物和特異性治療靶點提供了理論支持。

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參考文獻(xiàn)

Zhang M, Wang Y, Jiang L,?et al.?LncRNA CBR3-AS1 regulates of breast cancer drug sensitivity as a competing endogenous RNA through the JNK1/MEK4-mediated MAPK signal pathway.?J Exp Clin Cancer Res?2021; 40(1): 41.

說明：本文源自歐易生物微信公眾號