歐易簡化基因組測序助力性別特異性標記的篩選和表征！2021年11月10日，華東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部淡水動物育種重點實驗室，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室高澤霞教授課題組利用2b-RAD技術在Aquaculture（IF:4.242）發(fā)表了基于 2b-RAD 和轉錄組測序的（團頭魴♀×黑尾近紅鲌♂）雜交種性別特異性標記的篩選和表征的研究成果。研究中2b-RAD文庫構建參考于歐易生物技術文獻。

本研究中，在雜交種雌性中進行了人工誘導的雌性生殖，發(fā)現(xiàn)所有后代都是雌性。使用 2b-RAD 來篩選雜交物種的性別特異性標記，并通過轉錄組和基因表達水平的定量實驗驗證了一個雄性特異性分子標記。結合雌核發(fā)育種群所有雌性的結果和鑒定的雄性特異性標記，表明該雜交種是雌性同配體?(XX)，性別決定機制為XX/XY型。已鑒定的性別特異性標記對于提高雜交物種以及父本的全雄性/全雌性育種實踐的效率具有重要價值。

文章標題：Screening and characterization of sex-specific markers for the hybrid(Megalobrama amblycephala♀× Ancherythroculter nigrocauda♂) based on 2b-RAD and transcriptome sequencing

研究對象：團頭魴×黑尾近紅鲌?雜交種

發(fā)表期刊：Aquacultur

合作單位：華中農(nóng)業(yè)大學；武漢市水產(chǎn)技術推廣指導中心；武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司

涉及歐易生物技術：2b-RAD

?研究背景?

性別決定可以是雄性異配子（XY）、雌性異配子（ZW）、配子體性染色體、染色體缺失（ZZ/ZO）或常染色體型染色體類型。特別是魚類，其性別決定系統(tǒng)更為復雜多變，受到遺傳或環(huán)境因素的影響。了解性別決定機制的遺傳基礎對于提高養(yǎng)殖魚類的生產(chǎn)力具有重要意義。性別特異性標記對于研究性別決定機制、識別性別決定基因和揭示性別差異相關的遺傳結構至關重要。開發(fā)性別特異性標記并將其應用于魚類養(yǎng)殖實踐具有重要的生產(chǎn)意義和理論意義。

?研究結果?

1.雌核雜交種群體和表型性別鑒定

經(jīng)過PCR和Sanger測序驗證，所有的鯉魚科對照組在相應產(chǎn)物位置均被成功擴增。然而在雌性個體中未發(fā)現(xiàn)父系基因型。可見該群體中的個體可以被鑒定為雌核發(fā)育個體。?

圖1.雌核發(fā)育雜種群體的群體驗證。1-7代表父系個體；8-17代表雌核發(fā)育個體

共有40個性腺組織，包括20個來自雜交正常生殖的個體和20個雌核發(fā)育個體，通過石蠟包埋和H&E染色觀察，結果表明，雌核發(fā)育個體均為雌性，而雜交群體正常繁殖的前體細胞為雌性或雄性，其比例約為1:1。這一結果表明，該雜交物種是具有性別決定因素的雌性同配子(XX），性別決定機制為XX/XY型。?

圖2.通過組織學切片對雌雄同體生殖腺進行性別鑒定，并對雜交種群進行正常繁殖。（A）為雌核發(fā)育群體的卵巢切片，所有個體均為雌性。（B）（C）正常雄性和雌性的卵巢和睪丸切片

2.2b-RAD測序數(shù)據(jù)分析及候選性別特異性標簽篩選

為了在雜交魚中找到性別特異性標簽，作者使用2b-RAD測序對雜交魚的10只雄性和10只雌性進行基因型分型。高測序覆蓋率保證了本研究產(chǎn)生的性別特異性序列的高可靠性。利用性別相關SNPs (FDR＞4)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹品示，雌雄個體獨立聚在一起，并分別分成兩個大分支(圖3)。結果表明，這些標記的可靠性和群體可用于性別特異性標記的篩選。

為了識別雜交魚的性別特異性標簽或SNPs，我們提取了這些性別特異性標簽或SNPs，它們出現(xiàn)在一個性別的個體中而不是出現(xiàn)在其他性別的所有個體中。最后，在所有雄性個體中發(fā)現(xiàn)了9個特定的標簽但是沒有鑒定出雌性（表1），鑒定出30個snp與雜種群體性別顯著相關(P<10-5)。在這些SNPs中，有5個SNPs在所有雄性中是雜合的，而在所有雌性中是純合的(表2），進一步表明雜交種具有XX/XY性別判定系統(tǒng)。

圖3.基于2b-RAD序列的性別相關SNPs構建系統(tǒng)發(fā)育樹(FDR> 4)

表1. 九個候選雄性特定標簽的信息

表2. 五個顯著性相關SNPs的信息

3.侯選性別特異性標簽和SNPS的驗證

為了設計PCR擴增雄性特異性2b-RAD標簽和SNPs的引物，我們從雜交雄性魚基因組調查數(shù)據(jù)中獲得了這些標簽和SNPs的側翼序列。根據(jù)序列，為每個候選性別特異性標簽和SNP設計了三對引物。經(jīng)PCR和Sanger測序驗證，使用最佳引物成功擴增了九個候選雄性特異性標簽中的兩個（ref57033–1和ref57066–1），并且在所有雄性中成功擴增了性別特異性412 bp（ref57033–1）和326 bp（ref57660–1）片段，但在2b-RAD測序群體的雌性中未成功擴增（圖4A和B）。此外，其他7個雄性特異性標簽和5個性別特異性SNP被排除在外，因為它們可以從兩性中部分擴增，或者在所有雄性個體中都沒有擴增條帶。因此，這兩個標記及其引物可作為區(qū)分雌、雄個體的重要性別候選標記。

圖4.兩個候選雄性特異性2b-RAD標記物在三個不同群體中的驗證。通過兩對引物(ref57660-1-F/R、ref57033-1-F/R)的PCR擴增，在三個不同的群體中驗證了兩個雄性特異性標記(ref57660-1和ref57033-1），雄性特異性片段的擴增結果如圖?(A) ~(F)所示。（A)和(B)表示2b-RAD測序種群，（C)和(D)表示另一個雜交種群，（E)和(F) 表示黑尾近紅鲌種群

4.雜交群體與黑尾近紅鲌的遺傳性別

為了檢測這兩個雄性特異性標記的普遍性，使用候選雄性特異性2b-RAD標簽的引物對另外30個雜交個體（15個雄性和15個雌性）進行性別鑒定。正如預期，在所有雄性動物中成功擴增了性別特異性412 bp（ref57660-1）和326 bp（ref57660-1）片段，但在雌性動物中沒有擴增（圖4C和D）。此外，考慮到雜交群體來源于雌性團頭魴和雄性黑尾近紅鲌的雜交，雄性特異性標記可能是從父系那里遺傳來的，因此我們推測它們也可能用于鑒別黑尾近紅鲌體中的雄性。因此，我們選擇了30個黑尾近紅鲌個體（15只雄性和15只雌性）進行雄性特異性標記的驗證，結果表明，性別特異性412 bp和326 bp片段也僅在雄性個體中成功擴增（圖4E和F），這顯然證實了作者假設。所有這些結果表明，獲得了兩個真實的雄性特異性標記（ref57660–1和ref57033–1），為大規(guī)模育種過程中的性別鑒定提供有效的參考。

5.轉錄組測序分析和轉錄水平驗證的雄性特異性標記物

使用兩個雜交組（雌性和雄性組）構建了六個性腺cDNA文庫，并進行了質控。在單基因表達分析中，在雄性和雌性組之間共鑒定出21324個差異表達基因（DEG），與雌性組相比，雄性組中15299個DEG上調，6025個DEG下調（圖5A）。其中，3122個DEG僅在雄性中表達，在雌性中不表達。為了進一步驗證性別特異性標記的準確性，將兩個雄性特異性標記映射到DEGs序列，ref57660–1（326bp）與Trinity DN17103 c2g1（770bp）成功匹配，后者僅在雄性中表達。結果表明，該單基因可能是一個雄特異性基因，參與性別分化。然后我們設計了特異性定量引物Trinity DN17103 F/R（701 bp），并驗證其在雄性和雌性個體中的表達。結果表明，β-肌動蛋白的擴增帶在雄性和雌性個體中都是穩(wěn)定的，而靶帶僅在所有雄性個體中存在（圖5C），這進一步證實了2b-RAD分子標記的可靠性。

圖5.雄性特異性分子標記的基因表達水平驗證

?文章結論?

本文是第一個結合2b-RAD和轉錄組測序方法篩選團頭魴♀×黑尾近紅鲌♂雜交種的性別特異性標記研究。?首先，對雜種雌性進行人工誘導雌核發(fā)育，發(fā)現(xiàn)所有后代均為雌性。然后通過2b-RAD方法檢測到兩個雄性特異性標簽，并通過PCR擴增在雜交種群和黑尾近紅鲌種群中進行驗證。此后，通過結合轉錄組測序和定量驗證，從基因表達水平驗證雄性特異性性別標記的可靠性。結合雌核發(fā)育群體中所有雌性的結果和已鑒定的雄性特異性標記，表明該雜交種為雌性同配子（XX），性別決定機制為XX/XY型。更重要的是，創(chuàng)造了一種利用雄性特異性標記通過PCR和瓊脂糖電泳快速有效地確定雜交個體遺傳性別的方法，這對于結合人工控制育種技術進行大規(guī)模單性育種具有重要價值。

?參考文獻?

[1]Zhang Si-Qi,Xiong Xue-Mei,Shi Rui-Hui,Luo Li-Fei,Wang Gui-Ying,Tang De-Wen,Li Qing,Gao Ze-Xia. Screening and characterization of sex-specific markers for the hybrid (Megalobrama amblycephala ♀?×?Ancherythroculter nigrocauda ♂) based on 2b-RAD and transcriptome sequencing[J]. Aquaculture,2022,548(P2):

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青島歐易現(xiàn)擁有2b-RAD、MethylRAD、Super-GBS、LcWGS低深度重測序、2bRAD-M微生物菌群檢測五項特色技術，其中2b-RAD技術于2019年被認定為青島市“專精特新”技術。自成立以來，青島歐易已服務用戶兩千多名，用戶單位近兩百家，協(xié)助客戶發(fā)表SCI論文近兩百篇，積極參與并推動了科技服務產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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END

青島歐易? 撰文

本文系青島歐易原創(chuàng)

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