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大腸桿菌的分離和發(fā)酵培養(yǎng)基

2023-02-22 14:34 作者:健微講堂  | 我要投稿

大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常稱為大腸桿菌,于1885年被Escherich發(fā)現(xiàn)后,因其具備傳代及生長(zhǎng)速率快,易于培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)條件中的營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單,具備完整的基因組序列信息和清晰的遺傳學(xué)背景,被廣泛運(yùn)用于基因工程領(lǐng)域,如胰島素生產(chǎn)。

培養(yǎng)基作為細(xì)胞的“食物”,是細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的基礎(chǔ),大腸桿菌在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可能會(huì)表現(xiàn)出不同的性狀,而利用這些性狀的不同,可將部分菌種進(jìn)行區(qū)分或分離,此外,根據(jù)目標(biāo)菌種選擇合適的培養(yǎng)基可以低成本、穩(wěn)定的高表達(dá)。

根據(jù)培養(yǎng)基的用途可以將其分為分離培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基

大腸桿菌分離培養(yǎng)基:主要根據(jù)不同的大腸桿菌在培養(yǎng)基中的生產(chǎn)速度,代謝產(chǎn)物,對(duì)培養(yǎng)基中特定組分的需求利用情況不同等實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類的菌種進(jìn)行分離或篩選。

LB固體培養(yǎng)基:是一種主要組分為酵母提取物、胰化蛋白胨、NaCl瓊脂的非選擇性固體培養(yǎng)基,通常用于細(xì)菌的培養(yǎng)。LB中加入的瓊脂使培養(yǎng)基形成固體凝膠狀態(tài),細(xì)菌在其表面生長(zhǎng)。向LB固體凝膠中添加特定的抗生素(如氨芐青霉素、卡那霉素等),可以選擇性培養(yǎng)對(duì)該抗生素耐受的菌株并將非耐受的菌株去除,菌體對(duì)抗生素耐受的原因是由菌體質(zhì)粒中含有抗生素抗藥基因所賦予的。如:在制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的過程中,添加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基可作為篩選含氨芐青霉素基因質(zhì)粒的大腸桿菌。

伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基(EMB):是一種主要組分為蛋白胨,乳糖。磷酸氫二鈉鈉,瓊脂伊紅,美蘭的用于大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌的分離和鑒別的培養(yǎng)基,也適用于大腸菌群的分離培養(yǎng),為弱選擇性培養(yǎng)基。各成分的作用為:蛋白胨提供碳源和氮源;乳糖提供碳源;磷酸氫二鉀是緩沖劑;瓊脂是凝固劑;伊紅(Eosin Y)為酸性染料:美蘭(eosin-methylene blue)為堿性染料,二者在培養(yǎng)基中作為指示劑。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí),細(xì)菌帶正電,被伊紅染上紅色,再與美蘭結(jié)合而形成紫黑色菌落,帶有金屬光澤;若是產(chǎn)氣腸桿菌形成棕色菌落,并很少有金屬光澤;若是不能分解乳糖的細(xì)菌,如沙門氏菌和志賀氏菌,則形成無色或琥珀色半透明菌落;白色念珠菌形成蛛絲狀或羽毛狀菌落,凝固酶陽性葡萄球菌形成無色針尖大小的菌落。

麥康凱固體培養(yǎng)基(MAC):是一種主要用來檢驗(yàn)分離腸道菌的培養(yǎng)基,在藥典中規(guī)定可以用于大腸桿菌的檢測(cè),在食品標(biāo)準(zhǔn)中可用于腸道致病菌的分離。培養(yǎng)基中膽鹽及結(jié)晶紫對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用,大腸桿菌因?yàn)榭梢园l(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)為桃紅色,并且菌落周圍通常有明顯的沉淀環(huán),大腸菌群同樣能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,菌落也呈桃紅色。致病性的腸道菌(如志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌等)因不發(fā)酵乳糖,菌落呈無色。此培養(yǎng)基由于對(duì)大腸桿菌的專一性較弱(大腸菌群和大腸桿菌的菌落特征比較接近),若樣品中大腸菌群的含量比較高,分離大腸桿菌的效果較差。

大腸桿菌顯色固體培養(yǎng)基(TBX):利用酶底物法原理,對(duì)于大腸桿菌的分離和計(jì)數(shù)有高度的特異性,大腸桿菌特有的β-葡萄糖醛酸苷酶可分解培養(yǎng)基中的底物,使菌落呈藍(lán)綠色,而大腸菌群和其他大多數(shù)雜菌通常呈無色或其他顏色,革蘭氏陽性菌大多數(shù)不生長(zhǎng)。在干擾菌較多的情況下,顯色培養(yǎng)基的分離率遠(yuǎn)高于其它培養(yǎng)基。但是該培養(yǎng)基價(jià)格較高,有極少數(shù)大腸桿菌不產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶(如腸出血性大腸埃希氏菌O157菌),因此不能顯色。此培養(yǎng)基適用于食品、水、環(huán)境等檢測(cè)。

哥倫比亞MUG固體培養(yǎng)基:利用大腸桿菌可利用β-葡萄糖醛酸苷酶特異性分解MUG,在紫外燈照射下發(fā)出熒光,該培養(yǎng)基特異性較強(qiáng),極少數(shù)不產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌不能發(fā)出熒光。此培養(yǎng)基沒有選擇性,多數(shù)雜菌均能生長(zhǎng),通常用于含菌量較少的水中的大腸桿菌計(jì)數(shù)。

VRBA-MUG固體培養(yǎng)基:在VRBA基礎(chǔ)上添加了MUG,相比較于哥倫比亞MUG固體培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基具有選擇性,能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng),大腸桿菌和大腸菌群可在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)呈紫紅色菌落,周圍有沉淀環(huán),因?yàn)樘砑恿薓UG,在紫外燈下照射時(shí),大腸桿菌菌落可發(fā)出熒光,而大腸菌群則沒有熒光。此培養(yǎng)基一般用于食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)。

發(fā)酵培養(yǎng)基:為了在生產(chǎn)中更加利于菌種代謝產(chǎn)物的生成而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。

SOB(Super Optimal Broth)培養(yǎng)基:是一種富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,其配方為:2% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,10mM MgSO4。與LB培養(yǎng)基相比,SOB培養(yǎng)基中含有兩倍多的蛋白胨,富含更多的氨基酸及多肽。此外,SOB培養(yǎng)基中含有鎂離子,鎂離子是高密度培養(yǎng)必須的離子。利用SOB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌在普通條件(250rpm)下?lián)u瓶培養(yǎng),菌濃可達(dá)到OD600 3-5左右,如果提高轉(zhuǎn)速到350rpm,OD600最高能夠達(dá)到10-15。此外,大腸桿菌在SOB培養(yǎng)基中具有更高的轉(zhuǎn)化效率,因此SOB培養(yǎng)基常被用來制備感受態(tài)細(xì)胞。

SOC(Super Optimal broth with Catabolite repression)培養(yǎng)基:在SOB的基礎(chǔ)上添加終濃度20Mm的葡萄糖即為SOC培養(yǎng)基,其配方為:2% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,10mM MgSO4,20mM葡萄糖。培養(yǎng)基中的葡萄糖充當(dāng)分解代謝抑制物。一般來說,大腸桿菌傾向于優(yōu)先以葡萄糖作為碳源,培養(yǎng)基中由于葡萄糖的存在,其它碳源的分解就會(huì)被抑制。由于葡萄糖的存在,乳糖不會(huì)被代謝,乳糖操縱子被抑制,外源基因不會(huì)發(fā)生表達(dá),減少了外源基因表達(dá)給細(xì)胞生長(zhǎng)帶來的壓力。因此,利用SOC培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí),熱激后細(xì)胞生長(zhǎng)的速率會(huì)比LB培養(yǎng)基中高出很多。

2x YT (Yeast extract and Tryptone)培養(yǎng)基:是一種比LB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)更為豐富的培養(yǎng)基,配方為:1.6% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物,0.5% NaCl。與LB培養(yǎng)基成分相比,2x YT培養(yǎng)基中包含有更多的的酵母提取物和胰蛋白胨,營(yíng)養(yǎng)更加豐富,細(xì)胞可以生長(zhǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間,菌體濃度更高。2x YT培養(yǎng)基主要用來進(jìn)行大腸桿菌以及像是M13這樣的細(xì)菌噬菌體的培養(yǎng)。

TB(Terrific Broth)培養(yǎng)基:是一種添加了磷酸鹽的復(fù)合型培養(yǎng)基,配方如下:2 % 胰蛋白胨,2.4%酵母提取物,72mM K2HPO4,17mM KH2PO4,0.4% glycerol。與LB培養(yǎng)基相比,TB培養(yǎng)基中除了多出20%的胰蛋白胨和380 %的酵母提取物以外,還多了 0.4%的甘油作為額外的碳源。這些元素能夠支持大腸桿菌在正常的搖瓶培養(yǎng)條件下達(dá)到更高的菌體密度,其OD600可達(dá)5–8。該培養(yǎng)基通常用于蛋白質(zhì)表達(dá)和質(zhì)粒提取。

SB (Super Broth)培養(yǎng)基:其配方為:3.2% 胰蛋白胨,2% 酵母提取物,0.5% NaCl。與LB培養(yǎng)基相比,SB培養(yǎng)基成分中多出了220%的胰蛋白胨和380%的酵母提取物。該培養(yǎng)基的蛋白胨和酵母提取物中包含的主要營(yíng)養(yǎng)元素遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到飽和時(shí)所需的量。該培養(yǎng)基主要用于質(zhì)粒以及蛋白質(zhì)的提取。

M9培養(yǎng)培養(yǎng)基:最低鹽(M9)培養(yǎng)基含有必需鹽和氮,傳統(tǒng)上由葡萄糖、氨基酸和維生素作為補(bǔ)充物。M9培養(yǎng)基適用于大腸桿菌菌株的非選擇性培養(yǎng),用于克隆、生產(chǎn)DNA、質(zhì)粒DNA和重組蛋白。如果添加適當(dāng)?shù)目股兀策m用于選擇性培養(yǎng)帶有抗生素抗性的菌株。

GYT培養(yǎng)基:是一種可以用于各種細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基,是分子生物學(xué)常規(guī)試劑,主要由胰蛋白陳、酵母提取物、甘油等組成。

MBL培養(yǎng)基:是一種以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、KHPO4、(NH4)2HPO4、MgSO4為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基。

來源:玉珠隆生物 ?
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