阿爾茨海默癥的病理機制——酵母雙雜交技術(shù)
維生素C(即抗壞血酸:AA)是人體正常細(xì)胞健康和發(fā)育所必需的一種基本微量營養(yǎng)素。人體細(xì)胞本身不能產(chǎn)生維生素C，需要通過腸道吸收和血液循環(huán)從周圍環(huán)境中獲取維生素C。小鼠可以在肝臟中合成一定量的維生素C，然后分布到各組織中，但內(nèi)源性合成的VC不能完全滿足小鼠腦細(xì)胞的代謝需要，小鼠大腦仍然依賴于腸道對維生素C的吸收及其循環(huán)。
大腦的高強度代謝活性使這個器官特別容易受到氧化應(yīng)激和自由基損傷，VC作為人體內(nèi)高效的抗氧化劑，當(dāng)大腦中維生素C水平不足時會導(dǎo)致阿爾茨海默癥（AD）病人認(rèn)知能力下降加速，β-淀粉樣蛋白積累和沉積。因此了解大腦中AA的吸收機制，對理解不同疾病狀態(tài)下維生素C攝取變化的潛在病理機制具有重要意義。
在神經(jīng)元中，AA的攝取依賴于人類鈉依賴性維生素C轉(zhuǎn)運體-2 (hSVCT2)，這是大腦中主要表達(dá)的維生素C轉(zhuǎn)運體亞型。然而，目前對維生素C轉(zhuǎn)運體的工作方式知之甚少，也不知道它是如何在不同的細(xì)胞類型(包括對維生素C有高需求的細(xì)胞，如神經(jīng)元)中定向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運的。
2021年，加利福尼亞大學(xué)團隊在International Journal of Biological Macromolecules上發(fā)表的題為“Calsyntenin-3 interacts with the sodium-dependent vitamin C transporter-2 to regulate vitamin C uptake”的研究論文，利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選到了hSVCT2的互作蛋白Calsyntenin-3（CLSTN3），研究發(fā)現(xiàn)該組相互作用對VC吸收具有正向調(diào)節(jié)作用，對預(yù)防衰老相關(guān)的認(rèn)知衰退和AD具有重要的生理病理學(xué)意義。
文章思路與結(jié)果
酵母雙雜交篩選獲得了人VC鈉依賴轉(zhuǎn)運蛋白hSVCT2的互作蛋白CLSTN3
以hSVCT2 C端（567-650 aa）為誘餌，通過酵母雙雜交篩選成年人類大腦cDNA酵母文庫，結(jié)果獲得253個候選陽性克隆，PCR鑒定測序分析發(fā)現(xiàn)CLSTN3互作可信度較高，進(jìn)一步通過Y2H一對一驗證，發(fā)現(xiàn)hSVCT2 C端（567-650 aa）與hCLSTN3 (507–639 aa)在-His/+10 mM 3-AT篩選條件下存在相互作用。
在哺乳動物細(xì)胞中驗證hCLSTN3與hSVCT2存在相互作用
通過Co-IP、Dual-LUC、細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)進(jìn)一步驗證了全長蛋白hCLSTN3與hSVCT2在哺乳動物細(xì)胞中存在相互作用。
hCLSTN3對hSVCT2功能的影響
通過對比檢測hSVCT2單獨瞬轉(zhuǎn)SH-SY5Y，以及hCLSTN3和hSVCT2共同瞬轉(zhuǎn)SH-SY5Y后，細(xì)胞C-AA攝取情況，發(fā)現(xiàn)hCLSTN3和hSVCT2共表達(dá)可以增強細(xì)胞AA吸收水平。通過siRNA敲降hCLSTN3，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞AA吸收水平明顯下降，但hSVCT2表達(dá)量不變，說明蛋白hCLSTN3對hSVCT2功能具有輔助作用，表現(xiàn)為可以通過與其互作，提高h(yuǎn)SVCT2的AA轉(zhuǎn)運功能，但并不會調(diào)控其表達(dá)量。
在正常人及AD患者海馬體中SVCT2和CLSTN3的表達(dá)量差異
既往研究發(fā)現(xiàn)AD患者血漿維生素C水平低于健康人，本研究通過qPCR及WB檢測，發(fā)現(xiàn)在小鼠模型及AD臨床病人中，SVCT2和CLSTN3的表達(dá)量均低于正常個體。
Fig. 4 | Effect of AD on expression level of hSVCT2 and hCLSTN3 protein and mRNA in normal and AD hippocampus.
本研究結(jié)果表明hCLSTN3與hSVCT2相互作用，hCLSTN3表達(dá)與維生素C攝取呈正相關(guān)。這兩種蛋白在AD疾病狀態(tài)下下調(diào)提示AD患者的大腦中維生素C穩(wěn)態(tài)受損。
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