寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由德國(guó)G?ttingen分子生物科學(xué)中心在2019年9月2日發(fā)表于Cell Death & Differentiation（2020IF：15.828，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Steven A. Johnsen教授，研究表明USP22通過(guò)降低mTOR活性在結(jié)直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制功能。

研究背景

????????USP22是SAGA轉(zhuǎn)錄輔因子復(fù)合物的去泛素化亞基，是基因“癌癥死亡”特征的成員。USP22一直被認(rèn)為是一種有前景的治療靶點(diǎn)，因?yàn)槠涓咚奖磉_(dá)與多種實(shí)體瘤（包括結(jié)直腸癌CRC）的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存率差和高復(fù)發(fā)率相關(guān)。

摘要部分

????????作者試圖使用具有組織特異性Usp22消融的腸道致癌小鼠模型來(lái)研究Usp22在體內(nèi)腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用。此外，作者評(píng)估了人類(lèi)CRC細(xì)胞中USP22敲低對(duì)致瘤潛力的影響，并確定了潛在的分子機(jī)制。作者首次報(bào)道了USP22在體內(nèi)具有腫瘤抑制功能。有趣的是，腸道特異性Usp22缺失加劇了由Apc突變引起的腫瘤表型，導(dǎo)致生存率顯著降低和腸道腫瘤發(fā)病率升高。因此，人類(lèi)CRC細(xì)胞在體外和體內(nèi)USP22減少后顯示出增加的致瘤特性，并誘導(dǎo)與CRC患者不良結(jié)果相關(guān)的基因表達(dá)特征。值得注意的是，USP22丟失導(dǎo)致mTOR活性增加，其致瘤特性是由USP22丟失引起的。在這里，作者證明USP22可以在CRC中發(fā)揮腫瘤抑制功能，其中它的缺失通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR活性增加CRC負(fù)荷。重要的是，作者的數(shù)據(jù)揭示了USP22的腫瘤和背景特異性作用，表明USP22表達(dá)可以作為癌癥患者治療分層的標(biāo)志物。

研究?jī)?nèi)容

1.USP22在體內(nèi)抑制CRC腫瘤發(fā)生

????????基于Usp22高表達(dá)會(huì)增加腫瘤負(fù)荷的假設(shè)，作者檢查了組織特異性、條件性Usp22基因缺失在小鼠腸道腫瘤發(fā)生模型中的影響。為此，作者在有無(wú)雜合Apc1638N截?cái)嗤蛔兊那闆r下生成了Usp22缺失的小鼠。單獨(dú)的Usp22腸道丟失僅略微影響小鼠的總體存活率。令人驚訝的是，在Apc突變的背景下，Usp22缺失顯著降低了存活率，其中Apc1638N/+、Usp22fl/fl小鼠在他莫昔芬注射后14-33周死亡，而野生型或Usp22雜合動(dòng)物的存活時(shí)間明顯更長(zhǎng)。此外，腸道特異性Usp22缺失也與注射他莫昔芬和較短的結(jié)腸后體重減輕更多有關(guān)。有趣的是，在Apc1638N/+、Usp22fl/fl小鼠中，與同窩小鼠相比，結(jié)直腸腫瘤的數(shù)量和大小顯著增加。USP22在正常、健康的腸上皮和腫瘤的腸上皮中的蛋白質(zhì)水平以及mRNA水平都明顯減少。

研究結(jié)論：腸道中Usp22的缺失導(dǎo)致存活率降低并顯著增加腫瘤負(fù)荷。這些發(fā)現(xiàn)揭示了USP22在體內(nèi)實(shí)體瘤中的先前未知的腫瘤抑制功能。

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2.腸道內(nèi)Usp22的缺失會(huì)增加體內(nèi)腫瘤的侵略性生長(zhǎng)

????????在評(píng)估H&E染色的結(jié)腸切片時(shí)，作者在Usp22fl/fl動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)腫瘤區(qū)域擴(kuò)散到結(jié)腸內(nèi)肌層以外，表明Apc突變小鼠中Usp22的缺失不僅增加了結(jié)腸中的腫瘤數(shù)量和大小，但也促進(jìn)了腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)。此外，具有腸道特異性Usp22缺失的小鼠在結(jié)腸中顯示出上皮損傷。有趣的是，與野生型動(dòng)物相比，Usp22+/fl和Usp22fl/fl小鼠均顯示出較低程度的完整上皮。為了評(píng)估Usp22缺失后腫瘤生長(zhǎng)增強(qiáng)的潛在機(jī)制，作者分別用Ki67和CD31作為增殖和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記對(duì)Apc1638N/+小鼠的結(jié)腸切片進(jìn)行染色。實(shí)際上，Usp22fl/fl動(dòng)物的細(xì)胞增殖和血管生成均升高。

研究結(jié)論：腸道內(nèi)在Usp22缺失后，不僅導(dǎo)致腫瘤數(shù)量和大小增加，而且腫瘤侵襲性也升高。

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3.USP22減少增加了體外人CRC細(xì)胞的致瘤潛力

????????為了進(jìn)一步研究CRC細(xì)胞中的USP22功能，作者在體外檢查了USP22敲低對(duì)HCT116細(xì)胞中細(xì)胞生長(zhǎng)特征的影響。作者觀(guān)察到與對(duì)照相比， siUSP22敲低加速了HCT116結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖。此外，在USP22敲低后，遷移特性、細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成的潛力都提高了。與作者結(jié)果一致，TCGA研究網(wǎng)絡(luò)生成的人類(lèi)患者腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，USP22低表達(dá)往往與直腸腺癌預(yù)后不良相關(guān)。因此，作者試圖確定降低的USP22水平如何影響全基因表達(dá)和信號(hào)通路。為此，作者在對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染和USP22敲低的HCT116細(xì)胞中進(jìn)行了mRNA-seq分析。GSEA揭示與CRC患者不利結(jié)果相關(guān)的基因表達(dá)模式高度上調(diào)，而在USP22敲低后，與有利結(jié)果相關(guān)的基因下調(diào)。

研究結(jié)論：低USP22表達(dá)促進(jìn)了體外CRC細(xì)胞的致瘤特性，并影響與患者預(yù)后相關(guān)的基因表達(dá)模式。

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4.USP22缺失增強(qiáng)了體外和體內(nèi)的致瘤潛力

????????為了評(píng)估CRC細(xì)胞中USP22永久缺失的后果，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HCT116細(xì)胞中的USP22。雖然敲除USP22不影響細(xì)胞形態(tài)，但它增強(qiáng)了增殖，類(lèi)似于siRNA轉(zhuǎn)染。作者接下來(lái)通過(guò)將這些細(xì)胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中來(lái)檢查USP22缺失對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。與體外分析和基因缺失模型一致，USP22敲除加速了該異種移植模型中HCT116腫瘤的生長(zhǎng)。與條件性基因缺失研究一致，USP22缺陷型HCT116腫瘤顯示血管化增加。

研究結(jié)論：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的USP22敲除增強(qiáng)了體外和體內(nèi)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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5.USP22缺乏促進(jìn)mTOR激活

????????作者發(fā)現(xiàn)在HCT116細(xì)胞中USP22敲除后，幾個(gè)mTOR信號(hào)相關(guān)基因受到調(diào)節(jié)。mTOR通路是一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)，因?yàn)樗绊懓–RC在內(nèi)的許多人類(lèi)惡性腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活。作者在HCT116細(xì)胞中生成了一系列被mTOR抑制劑雷帕霉素下調(diào)的基因并進(jìn)行了GSEA。該分析表明，在雷帕霉素處理后通常表達(dá)降低的基因在USP22敲低細(xì)胞中富集，表明USP22表達(dá)降低可能促進(jìn)mTOR通路的活性。由mTOR信號(hào)控制并在USP22減少后上調(diào)的基因包括白細(xì)胞介素20受體亞基β(IL20RB)、磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH)和DLG4。事實(shí)上，作者使用qRT-PCR驗(yàn)證了USP22敲除增加了這些因子的mRNA表達(dá)，并且可以通過(guò)用臨床批準(zhǔn)的mTOR抑制劑（mTORi）依維莫司處理細(xì)胞來(lái)恢復(fù)這種影響。作者接下來(lái)試圖確定在USP22敲除后激活mTOR通路活性的機(jī)制，并確定了PRKAA2基因，編碼AMP激活的蛋白激酶α2（AMPKα2），是USP22依賴(lài)性的。在Usp22敲除小鼠的腸上皮細(xì)胞中證實(shí)了Prkaa2的下調(diào)。作者認(rèn)為USP22的缺失可能通過(guò)涉及AMPKα2表達(dá)降低的機(jī)制直接導(dǎo)致mTOR活性增加。因此，作者使用蛋白質(zhì)印跡檢查了mTOR靶核糖體蛋白S6的磷酸化狀態(tài)，并證實(shí)S6磷酸化在USP22缺失后確實(shí)增加了。重要的是，這種效果可以通過(guò)mTORi依維莫司和雷帕霉素治療來(lái)逆轉(zhuǎn)。事實(shí)上，在Usp22缺陷的Apc1638N腫瘤中pS6水平也增加。接下來(lái)，作者試圖研究去泛素化蛋白USP22的缺乏如何降低PRKAA2 mRNA水平并促進(jìn)mTOR活性。作者假設(shè)這些影響可能與SAGA復(fù)合物中USP22的功能有關(guān)，并對(duì)H3K9ac進(jìn)行了ChIP，這是由SAGA的GCN5乙酰轉(zhuǎn)移酶亞基介導(dǎo)的。與作者的假設(shè)一致，在缺乏USP22的細(xì)胞中，PRKAA2上的H3K9ac占有率降低了20倍。此外，GCN5的敲低還導(dǎo)致PRKAA2 mRNA水平降低。

研究結(jié)論：USP22缺乏導(dǎo)致GCN5介導(dǎo)的H3K9ac水平降低，從而降低PRKAA2 mRNA表達(dá)并提高mTOR活性。

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6.USP22缺失使結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)mTOR抑制劑敏感

????????為了評(píng)估USP22缺陷腫瘤的靶向性，作者旨在抑制mTOR通路。有趣的是，用依維莫司處理HCT116細(xì)胞顯著降低了USP22耗盡細(xì)胞的增殖，而僅略微影響對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。一致地，依維莫司處理也逆轉(zhuǎn)了USP22缺失細(xì)胞的克隆形成潛力增加。此外，沉默mTORC1關(guān)鍵成分RPTOR同樣降低了USP22敲除細(xì)胞的增殖和克隆能力，并逆轉(zhuǎn)了mTORi響應(yīng)基因的上調(diào)。為了證實(shí)USP22缺陷腫瘤對(duì)mTOR抑制的敏感性，將HCT116 USP22野生型和敲除細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠中。用依維莫司或載體溶液治療動(dòng)物并每天測(cè)量腫瘤大小。與作者之前的觀(guān)察結(jié)果一致，USP22缺失促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。然而，這些影響可以通過(guò)用依維莫司治療動(dòng)物來(lái)挽救，其中USP22缺失的腫瘤在依維莫司治療后顯示腫瘤生長(zhǎng)減少71%，而USP22野生型細(xì)胞僅減少27%。

研究結(jié)論：體外和體內(nèi)USP22缺失后mTOR通路的激活引入了治療脆弱性，使USP22缺陷的CRC細(xì)胞對(duì)mTOR抑制特別敏感。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的結(jié)果表明USP22不能?chē)?yán)格地被視為致癌基因。事實(shí)上，它可以在某些生物學(xué)背景下起到腫瘤抑制作用。需要進(jìn)一步的工作來(lái)確定哪些腫瘤類(lèi)型或亞組將從USP22活性的抑制中增殖最快，在其他情況下，是否可以利用USP22活性降低的個(gè)體化治療方法對(duì)mTOR治療進(jìn)行患者分類(lèi)。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41418-019-0420-8