病原微生物的分類

根據病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類，第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。

第一類病原微生物：是指能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經宣布消滅的微生物。我國目前規(guī)定的第一類病原微生物全是病毒，沒有細菌，如高致病禽流感病毒、非洲豬瘟病毒、天花病毒、剛果熱病毒、埃博拉病毒、委內瑞拉病毒、黃熱病毒等，共計29種病毒。

第二類病原微生物：是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。如狂犬病病毒，此次新型冠狀病毒暫按照第二類病原微生物進行管理。炭疽芽孢桿菌、布氏桿菌等也屬于第二類病原微生物。

第三類病原微生物：是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物。

第四類病原微生物：是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。

根據衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》要求,擬從事的病原微生物實驗活動應與對應的生物安全防護水平相適應。

安全級別：

根據對人體安全的潛在威脅，可分為4個級別。

1級：基本對人體不致病，一般超凈臺即可操作；

2級：對人體條件致病，不傳染，但需在二級生物安全柜操作，感染后可以有效治療；

3級：對人體嚴重致病，具有傳染性，可以有效治療；

4級：對人體嚴重致病，極具傳染性，目前尚無有效治療方法。

病原微生物的檢測方式

為了提高各種疾病診斷、治療效果，保障人們身體健康，就要求臨床檢驗技術更加準確、快速。那么微生物檢測技術有哪些呢？

傳統(tǒng)檢測方式

對病原微生物進行傳統(tǒng)檢測的過程中，大都需要進行染色、培養(yǎng)，并在此基礎上進行生物鑒定，以便能夠鑒別不同種類的微生物，檢測價值較高。傳統(tǒng)檢測方式主要包括涂片鏡檢、分離培養(yǎng)與生化反應、組織細胞培養(yǎng)三種。

01涂片鏡檢

病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色后可借助顯微鏡觀察其大小、形態(tài)、排列等。直接涂片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態(tài)的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接進行涂片鏡檢的方式檢查速度較快，能夠對于形態(tài)特殊的病原體進行直觀的檢查，不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。

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02分離培養(yǎng)與生化反應

分離培養(yǎng)主要用于臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。所以醫(yī)學領域不斷對此進行了研究，采用了自動化的培養(yǎng)和鑒定的器械，對傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式進行了改善，提升了檢測的準確性，也大大加快了檢測速度。
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03組織細胞培養(yǎng)

組織細胞主要包括衣原體、病毒和立克次體等，由于不同的病原體內的組織細胞種類不同，所以從病原微生物中活體取出組織后需采用傳代培養(yǎng)的方式進行活細胞的培養(yǎng)，進而再將培養(yǎng)的病原微生物接種到組織細胞中進行培養(yǎng)，以盡可能的減少細胞的病變。此外，也可以在培養(yǎng)組織細胞的過程中，可以將病原微生物直接在敏感動物體內接種，再根據動物的組織器官出現(xiàn)的改變對病原體的特質進行檢驗。

血清學檢測

采用血清學檢測能夠對病原微生物進行快速鑒定，血清學檢測技術的基本原理是通過已知的病原體抗原以及抗體對病原體進行檢測，與傳統(tǒng)的細胞分離培養(yǎng)相比，血清學檢驗的操作步驟簡單，其常用的檢測方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術和酶聯(lián)免疫測試技術等。酶聯(lián)免疫測試技術的應用能夠大幅度提高血清學檢測的敏感性和特殊性，不僅能夠對檢測樣本中的抗原進行檢測，還能夠檢測抗體成分。

免疫學檢測

免疫學檢測又被稱為免疫磁珠分離技術，該技術能夠將病原體中的致病菌和非致病菌分離開，其基本原理為：利用磁珠微球將特定病原體的單一抗原或者多種抗原集合在一起，通過抗原體反應和外部磁場的作用，將致病菌從病原體中分離出來，目前我國已經研制出了多種具有針對性的免疫磁珠，例如有針對李斯特菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌等細菌的免疫磁珠。

基因檢測技術

隨著分子生物檢測技術的發(fā)展，其能夠有效地對病原微生物進行鑒定，病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列對病原微生物的種類進行鑒別，所以基因檢測技術以其自身獨到的優(yōu)勢被臨床醫(yī)學檢驗領域廣泛應用。

01聚合酶鏈式反應(PCR)

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段并進行擴增的技術。由于PCR可以對待測基因進行擴增，特別適用于病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強，可能會造成假陽性的出現(xiàn)。PCR技術在近20年里發(fā)展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。該方法也是本次疫情新冠病毒的主要檢測方法。

1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，可同時擴增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。

多重PCR具有：

(1)高效性，在同一反應體系內可同時檢出多種病原微生物，或對同一病原微生物的不同型別進行分型；(2)系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌感染；破傷風桿菌，炭疽桿菌，產氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰(zhàn)傷感染細菌感染；

(3)經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時被檢出，節(jié)省試劑、節(jié)約費用、節(jié)省時間，為臨床提供更快更多更準確的診斷信息?；蛐酒夹g與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因芯片的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優(yōu)勢互補，已廣泛應用于病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸芯片，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產物與病原菌多重PCR基因芯片檢測體系雜交，可根據雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。

實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預后評估等具有重要價值，為流行病學調查提供幫助。熒光基團標記的特異性引物可準確反映病原體感染和藥物療效，特別適用于不可人工培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。
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02基因芯片技術

基因芯片(Gene chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA芯片，是指通過微陣列技術將高密度DNA片段通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等研究。將基因芯片技術應用到病原微生物的診斷中，可明顯縮短診斷時間，同時還能檢驗出病原體是否存在耐藥性，以及對哪些藥物耐藥，對哪些藥物敏感等，從而為臨床用藥提供參考。但是該項技術的制作成本較高，芯片檢測的敏感性也需提高，所以該項技術還主要用于實驗室研究，未能在臨床中得到廣泛應用。
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03核酸雜交技術

核酸雜交是病原微生物中具有互補序列的核苷酸單鏈在細胞內融合形成異質雙鏈的過程，導致發(fā)生雜交的因素是核酸與探針發(fā)生化學反應，從而對病原微生物進行鑒定。目前用于對病原微生物進行檢測的核酸雜交技術主要有核酸原位雜交和膜上印跡雜交。核酸原位雜交是指病原體細胞中的核酸與標記探針進行雜交。膜上印跡雜交是指將病原體細胞的核酸分離出后，將其進行純化后與固相支持物相結合，然后與核酸探針進行雜交。核酸雜交技術具有操作方便、快速的優(yōu)點，而且適用于敏感、特異的病原微生物。
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04其它基因檢測技術

分子生物學技術飛速發(fā)展，各種新的基因檢測手段不斷出現(xiàn)。環(huán)介導恒溫核酸擴增法(1oop-mediated isothermal amplification of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區(qū)域設計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環(huán)狀結構和鏈置換對目標DNA大量擴增。目前幾年LAMP已被廣泛應用于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗、生物安全等各方面。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA)是一種根據病原體基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復序列的特征來對病原體基因分型的一種技術，廣泛應用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定。

近年來，隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，各種病原微生物高通量檢測技術可達到準確度更高、敏感度更好、快速省時、無污染、簡單方便的特點，這些技術和方法必將發(fā)揮越來越重要的作用，為將來病原微生物的診斷分析和防治打下堅實的技術基礎。

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