作者︱于美玲

來源︱Bio-protocol第三屆生物實驗短視頻大賽

一、視頻摘要

目前多數(shù)實驗首先需要進行體外細胞實驗來驗證其表型與機制，比如真核質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染來研究兩者之間的相互作用與分子機制。因此對于細胞的培養(yǎng)狀態(tài)、傳代與鋪板的密度的要求至關(guān)重要。而細胞經(jīng)多次分裂增殖后彼此匯合形成單層細胞,覆蓋于培養(yǎng)瓶的底面；隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，培養(yǎng)基營養(yǎng)成被消耗，代謝物逐漸增多，為保持細胞的狀態(tài)，因此需要將培養(yǎng)的細胞按一定比例稀釋后(如1:2)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中,給予新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

二、關(guān)鍵詞

Caco-2細胞、細胞傳代、鋪板

三、試劑、耗材或儀器

試劑：

1．10% DMEM培養(yǎng)基（GOBIO）

2. PBS溶液（Solarbio）

3. PS溶液（Solarbio）

耗材：

1. 15ml?離心管

2. 50ml?離心管

3.?六孔板

4.?細胞培養(yǎng)皿

儀器和軟件

低速離心機

生物安全柜

四、實驗操作

1. 紫外照射30分鐘超凈臺，并配置10% DMEM培養(yǎng)基（5mL FBS+45mL DMEM），并以1：100的比例加入青鏈霉素，并在37°C水浴鍋預(yù)熱10min；

2. 取出-80°C冰凍的細胞孵箱融化復(fù)蘇，加入15mL離心管，并加入1mL 10% DMEM培養(yǎng)基，1000 rpm/min離心3min除去上清液；

3. 離心后，細胞重懸于1mL 10% DMEM培養(yǎng)基中，接種于預(yù)先加入7mL的細胞培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%CO2?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 觀察細胞生長情況，待細胞生長到90%時，在已殺菌的超凈臺中吸去之前的培養(yǎng)基，PBS清洗三次；

5. 棄去PBS,加入1mL 0.25%的胰酶（含EDTA）浸潤，棄去再加入1mL，置于孵箱消化3min；

6. 3min后加入同等體積的10% DMEM培養(yǎng)基終止消化，將其吸入15mL離心管中，1000 rpm/min離心3min；

7. 3min后加入2mL 10% DMEM培養(yǎng)基重懸，按1:2比例進行傳代，分別取1mL接種于預(yù)先加入7mL的細胞培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%CO2?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8. 待細胞生長至90%后，按照實驗要求以一定的密度進行鋪板，在此過程可以將所需的細胞混勻后，再吸入至每孔中保證細胞均勻鋪板。待細胞生長至實驗所需要數(shù)量后方可進行后續(xù)實驗。

五、注意事項

1. 在凍存細胞時，要保證細胞慢凍速溶的原則；

2. 為了更好的使細胞均勻鋪板，在鋪板過程中方可先將所需總細胞數(shù)量混合后再進行鋪板，保證每孔細胞數(shù)相同。

3. 在細胞傳代與鋪板中，要保證無菌操作，保證細胞傳代過程中不被污染；

4. 將細胞傳入培養(yǎng)皿后，左右上下各晃動十次后，置于生物安全柜中靜止數(shù)分鐘方可置于孵箱中培養(yǎng)。

Bio-protocol 簡介? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

Bio-protocol于2011年在斯坦福大學(xué)創(chuàng)建, 致力于搭建全球權(quán)威的、高質(zhì)量的生物實驗方案分享平臺，以助力科學(xué)發(fā)現(xiàn)。Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行評審的國際學(xué)術(shù)期刊，發(fā)表高質(zhì)量的生命科學(xué)實驗方案，旨在提高科研的可重復(fù)性。至今，Bio-protocol已發(fā)表了來自全球上萬名優(yōu)秀科研工作者（包括多名諾貝爾獎獲得者）的4000多篇實驗方案，并且同 Science、eLife等12家國際權(quán)威科學(xué)雜志建立長期合作關(guān)系，共同促進生命科學(xué)研究的可重復(fù)性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收錄。

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