一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

（1）掌握反轉(zhuǎn)錄PCR的原理

（2）掌握反轉(zhuǎn)錄PCR的操作技術(shù)

（3）以原核生物為材料進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增

?

二、實(shí)驗(yàn)原理

（1）反轉(zhuǎn)錄PCR原理

（2）PCR擴(kuò)增原理

?

三、材料、試劑、儀器與設(shè)備

（1）材料：大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物

（2）試劑：RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR mix

（3）儀器與設(shè)備：移液槍、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、天平、電磁爐等

?

四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）細(xì)菌RNA提取

① 挑取大腸桿菌單菌落于 LB 中37 ℃ 180 rpm 振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。

② 向 1.5 mL 離心管中加入 1 mL 菌液，12,000 rpm 離心 2 min。除去上清留下菌體沉淀。

③ 用 100 μL溶菌酶重懸菌體沉淀并輕輕敲打混勻。

④ 加入200 μL RNA裂解液，混勻，室溫孵育3-5 min。

⑤ 加入300 μL RNA稀釋液，混勻，室溫放置3-5 min。

⑥ ?加入 0.5 倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻，并將此混合物轉(zhuǎn)移到離心柱裝配體中。

12,000 rpm 離心 1min。

⑦從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中的液體。將離 心柱裝回到收集管上。加 600 μL RNA 洗液于離心柱裝配體，12,000 rpm 離心 1 min。

⑧加入50 μL DNA酶I孵育液，室溫孵育15min。

⑨重復(fù)⑦兩次。?

⑩ 清空收集管，12,000 rpm 離心 2 min。將離心柱從收集管上轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 洗脫管上，向膜上加 60 μL 無(wú)核酸酶水。

14,000 rpm 離心 1 min。丟棄離心柱。蓋好RNA 的洗脫管，存于‐80 ℃保存?zhèn)溆谩?

（2）cDNA合成

① 于冰上加入以下反應(yīng)組分：

總 RNA? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ????50 ng ~ 1 μg

RTIII All-in-one Mix ?????????4 μL

dsDNase? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?????1 μL

Nuclease-free water ??????????to 20 μL

?

② 輕輕吸打混勻，瞬離。

③ 37 ℃溫育2 min，去除基因組DNA；55 ℃溫育15 min 。

④ 85 ℃溫育5 min以終止反應(yīng)，迅速將獲得的cDNA置于冰上。

（3）16S rDNA擴(kuò)增與檢測(cè)

反應(yīng)體系（25 μL）：?

cDNA 模版 ????? ? ? ? ? ???1 μL

上游引物（10 μM）? ??1 μL

下游引物（10 μM）????1 μL

PCR Mix (2X)? ? ? ? ?????12.5?μL????

? ? ?? ddH2O? ? ? ? ? ? ?????9.5 μL

?反應(yīng)程序：

95 ℃ 3 min；94℃?30 sec，56 ℃ 30 sec，72 ℃ 2 min，35 循環(huán)；72 ℃ 5min；

12 ℃保存。取 5μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，于1％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

?

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

1、RNA提取過(guò)程注意事項(xiàng)有哪些？2、提高RNA提取濃度和質(zhì)量的方法？

?