近年來，干細(xì)胞外泌體載藥治療關(guān)節(jié)炎吸引了很多該研究領(lǐng)域的大家們注意。外泌體因?yàn)槟茉诩?xì)胞間穿梭，有利于細(xì)胞間物質(zhì)與信息的交換，其可以通過裝載外來藥物來改變受體細(xì)胞功能狀態(tài)。外泌體載藥系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)解決了部分溶解度差、副作用大的藥物不能在臨床使用的問題。今天小編就帶來一篇“Chitosan oligosaccharides packaged into rat adipose mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles facilitating cartilage injury repair and alleviating osteoarthritis”AMSCs衍生的外泌體載殼寡糖治療骨關(guān)節(jié)炎的新思路，影響因子為10.435，發(fā)表在Nanobiotechnology雜志上，發(fā)表時(shí)間為2021年10月，該文章主要探究了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AMSC）衍生的細(xì)胞外囊泡（EV）與殼寡糖（COS）結(jié)合在軟骨損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制。接下來通過作者得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來分析這篇文章吧！

1. 鑒定大鼠 AMSCs 衍生的 EVs、EVs-COS

為了確定用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的 EV 和 COS 的最佳濃度，用不同濃度的 EV 和 COS 處理軟骨細(xì)胞 48 小時(shí)，然后確定它們的活力。如圖1所示：與未處理的細(xì)胞相比，暴露于5、10、20和50 μg/mL EV處理后?的細(xì)胞活力顯著增加（P?< 0.05），并且在用 20 μg/mL EV 處理的細(xì)胞活力最高。另外，40、80、160、320、640、1280 μg/mL COS?處理細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P?< 0.05），320 μg/mL COS處理細(xì)胞活力最高?；谶@些結(jié)果，選擇 20 μg/mL EVs 和 320 μg/mL COS 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從大鼠 AMSC 中分離的 EV 使用 TEM、NTA 和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行表征。TEM 顯示提取的物質(zhì)呈杯狀或近圓形，直徑約 100 nm。NTA結(jié)果顯示分離物質(zhì)的主峰約為120 nm，平均峰為133.9 ± 0.8 nm。此外，Western blot結(jié)果表明，作為EV標(biāo)志物的CD3、TSG101和CD9均在EV中表達(dá)，而calnexin僅在細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果表明 EV 從大鼠 AMSC 中成功分離。COS與EVs結(jié)合后，作者分別用TEM和NTA觀察細(xì)胞外囊泡-殼聚糖寡糖偶聯(lián)物（EVs-COS）的形態(tài)并測定其大小。EVs-COS 的形態(tài)接近圓形，直徑約為100 nm。NTA 結(jié)果顯示 EVs-COS 的主峰為139 nm，平均峰為183.4 ± 1.5 nm，這表明 EVs-COS 的尺寸大于 EVs 的尺寸（如圖2所示）。

結(jié)論：EV 從大鼠 AMSC 中成功分離，并且EV可與COS實(shí)現(xiàn)結(jié)合

2. EVs-COS增強(qiáng)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡

為了了解EVs-COS對軟骨損傷修復(fù)的影響，作者使用IL-1β建立軟骨細(xì)胞損傷模型。在培養(yǎng)24、48 和 72 小時(shí)后，測量了細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，與對照組相比，IL-1β組的細(xì)胞活力顯著受到抑制。24 h后IL-1β組和IL-1β+COS組細(xì)胞活力無顯著差異。與IL-1β組相比，IL-1β+EVs和IL-1β+EVs-COS組的細(xì)胞活力顯著增加。培養(yǎng)48、72 h后，IL-1β+COS、IL-1β+EVs和IL-1β+EVs-COS組細(xì)胞活力較IL-1β組顯著增強(qiáng)。同時(shí)，IL-1β+EVs-COS組的細(xì)胞活力比IL-1β+COS組的細(xì)胞活力增強(qiáng)更顯著。培養(yǎng)48 h或72 h后，IL-1β+EVs-COS組的細(xì)胞活力也顯著高于IL-1β+EVs組?；谶@些結(jié)果，選擇處理 48 小時(shí)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

流式細(xì)胞術(shù)用于確定不同處理方法處理的軟骨細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡情況。對照組和IL-1β組細(xì)胞凋亡率分別為2.99±0.08%和21.26±1.11%，與對照組相比，IL-1β組細(xì)胞凋亡率顯著增加。然而，當(dāng)用 COS、EVs 和 EVs-COS 處理 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別降低至 9.12 ± 0.49%、7.64 ± 0.37% 和 6.94 ± 0.34%。此外，IL-1β+EVs-COS組的細(xì)胞凋亡率顯著低于IL-1β+COS組（如圖3所示）。

結(jié)論：IL-1β可以顯著抑制軟骨細(xì)胞的活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而EVs-COS可以逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞活力和凋亡的變化。此外，EVs-COS的細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡變化高于COS。

3. EVs-COS促進(jìn) IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞遷移

作者使用 Transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了 EVs-COS 在 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞遷移中的作用。Transwell 結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-1β 顯著減少細(xì)胞數(shù)量，而 COS、EVs 和 EVs-COS 明顯增加了 IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量減少。IL-1β+EVs-COS組細(xì)胞數(shù)顯著高于IL-1β+COS組。劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與 Transwell 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似（如圖4所示）。

結(jié)論：IL-1β 可以抑制軟骨細(xì)胞遷移，而 EVs-COS 促進(jìn)由 IL-1β 引起的軟骨細(xì)胞低遷移。

4.?EVs-COS影響軟骨細(xì)胞功能的分子機(jī)制研究

為了探索潛在的分子機(jī)制，使用 RT-qPCR 和Western blot確定了 IL-1β、COL1A1、COL2A1、OCN和RUNX2、Akt1 和 PI3K 等相關(guān)基因的表達(dá)水平。與對照組相比，IL-1β被IL-1β誘導(dǎo)顯著上調(diào)。COS和EVs-COS治療組可以逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的顯著上調(diào)趨勢，并且EVs-COS 的作用高于COS；IL-1β組COL1A1和COL2A1的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)；而與IL-1β 組比較，IL-1β+COS、IL-1β+EVs、IL-1β+EVs-COS組中COL1A1和COL2A1?mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；與對照組相比，IL-1β組中OCN和RUNX2的mRNA表達(dá)顯著降低，而COS，EVs和EVs-COS的處理可以恢復(fù)其表達(dá)。Akt1 和 PI3K 的 mRNA 表達(dá)與OCN mRNA 的表達(dá)相似。此外，與對照組相比，IL-1β誘導(dǎo)后c-Myc mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而COS、EVs和EVs-COS處理組中c-Myc mRNA表達(dá)顯著增加。然而，p53 mRNA表達(dá)的趨勢與c-Myc表達(dá)的趨勢相反。與對照組相比，IL-1β組p-Akt/Akt水平顯著下調(diào)，而COS、EVs和EVs-COS治療后，其水平顯著上調(diào)（P ?< 0.05），EVs-COS 的效果優(yōu)于 COS（如圖5所示）。

結(jié)論：EVs-COS 可以通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞特異性基因（COL1A1 和 COL2A1）、成骨細(xì)胞相關(guān)基因（OCN和 RUNX2）來影響軟骨細(xì)胞的活力、凋亡和遷移，凋亡相關(guān)基因（c-Myc和p53 ）和 Akt/PI3K 通路，從而改善軟骨損傷修復(fù)和OA。

5. EVs-COS對軟骨組織損傷具有緩解作用，可治療軟骨組織損傷

通過軟骨組織的HE染色進(jìn)一步研究從對照組、損傷模型、COS、EVs和EVs-COS組大鼠中分離的軟骨組織，以及與大鼠軟骨損傷和EVs-COS治療相關(guān)的組織學(xué)變化。對照組顯示正常軟骨組織，無炎性細(xì)胞因子浸潤。造模后模型組軟骨組織損傷腫脹，軟骨基質(zhì)變性，炎性細(xì)胞因子浸潤（如圖6所示）。結(jié)果表明，COS、EVs和EVs-COS組軟骨組織損傷得到緩解，EVs-COS對軟骨組織損傷有較好的治療效果。

結(jié)論：EVs-COS 促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)和改善 OA。

6. 相同表達(dá)模式中DEGs的篩選和功能分析

經(jīng)比較，COS與模型組之間、EVs-COS與模型組之間、EVs-COS與COS組之間共鑒定出2091、503和412個(gè)DEG。通過比較COS與模型、EVs-COS與模型、EVs-COS與COS 之間的DEG，并在至少兩個(gè)對照組中保留DEG，獲得760個(gè)DEG用于進(jìn)一步的表達(dá)趨勢聚類分析。隨后利用Mfuzz算法對得到的760個(gè)DEGs的表達(dá)模式進(jìn)行分析，觀察不同處理下目的基因的表達(dá)趨勢。四個(gè)表達(dá)模式，簇1、2、3 和 4被聚類，同時(shí)，對于每個(gè)集群中的DEG做BP和KEGG富集分析。發(fā)現(xiàn)簇1中的 DEGs 在同種異體移植排斥、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、吞噬體、經(jīng)典Wnt信號通路（SFRP5、SOX9和GLI1）的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對轉(zhuǎn)化生長因子β刺激的反應(yīng)中顯著富集、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)和軟骨凝聚。簇2中的DEGs與ECM-受體相互作用、粘著斑、PI3K-Akt信號通路（COL1A1、COL3A1、ITGA4、BAD和FOXO3）和蛋白水解密切相關(guān)。同時(shí)，簇3中的DEGs 參與心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號、AMPK信號通路（PPP2R3A、CPT1B和ACACB）以及鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)節(jié)。最后，簇4中的DEGs在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、MAPK 信號通路（CACNA1S、CACNG1和MAPK12）、磷酸戊糖通路、肌節(jié)組織、肌肉收縮、骨骼肌組織發(fā)育和肌原纖維組裝中發(fā)揮重要作用（如圖7所示）。

結(jié)論：EVs-COS可以通過對經(jīng)典Wnt、PI3K-Akt、AMPK 和 MAPK 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)來促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)和緩解 OA

文章總結(jié)：作者對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AMSC）衍生的細(xì)胞外囊泡（EVs）與殼寡糖（COS）結(jié)合是否可以治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷進(jìn)行了功能研究和機(jī)制探索。作者首先以IL-1β誘導(dǎo)的軟骨損傷細(xì)胞模型和EVs-COS結(jié)合治療入手，證明了IL-1β處理顯著抑制軟骨細(xì)胞的活力和遷移，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，而EVs-COS則逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的變化，EVs-COS的作用優(yōu)于COS。然后通過RT-qPCR和Western blot方法觀察到軟骨損傷后相關(guān)基因和蛋白的變化。隨后通過測序手段分析了EVs-COS參與的信號通路，得出聚集成四種表達(dá)模式的760個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)與經(jīng)典Wnt、PI3K-Akt、AMPK和MAPK信號通路的負(fù)調(diào)控相關(guān)。縱覽全文，作者通過構(gòu)建的體內(nèi)和體外大鼠軟骨損傷模型，系統(tǒng)地研究了包裝到大鼠AMSC-EV中的低分子殼寡糖（COS）對軟骨損傷的影響和相關(guān)機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)為治療基于軟骨損傷的OA和其他退行性關(guān)節(jié)疾病的藥物開發(fā)提供了新的見解和策略。

延伸思路：對于通過測序手段分析的差異基因及其調(diào)控的信號通路本文并未設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，在分子機(jī)制方面可從這個(gè)角度進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探索。

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?文獻(xiàn)來源：Li S, Liu J, Liu S, Jiao W, Wang X. Chitosan oligosaccharides packaged into rat adipose mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles facilitating cartilage injury repair and alleviating osteoarthritis. J Nanobiotechnology. 2021 Oct 26;19(1):343.