5+腫瘤+預(yù)后模型+實(shí)驗(yàn)
在全球癌癥相關(guān)死亡中，肝細(xì)胞癌（HCC）排名第二。大多數(shù)HCC的高血管特征凸顯了血管生成在治療中的重要性。本研究旨在確定能夠表征HCC血管生成分子特征的關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步探索改善患者預(yù)后的治療靶點(diǎn)。
1. 基于肝癌血管生成相關(guān)基因的預(yù)后模型構(gòu)建
作者分析的第一步是對(duì)TCGA和ICGC隊(duì)列進(jìn)行單變量Cox回歸。在TCGA和ICGC隊(duì)列中，分別確定了3101個(gè)和917個(gè)基因與HCC生存相關(guān)。與血管生成相關(guān)的基因集相交后，確定了32個(gè)與HCC預(yù)后相關(guān)的血管生成相關(guān)基因（圖1A）。然后，作者使用LASSO回歸分析篩選出了29個(gè)特征基因（圖1B、C）。在TCGA隊(duì)列中使用這29個(gè)基因進(jìn)行多變量Cox回歸分析后，確定了14個(gè)ARPGs作為最佳特征基因集，并顯示了危險(xiǎn)比值（圖1D）。通過HPA數(shù)據(jù)庫(kù)，作者發(fā)現(xiàn)TPX2、KIF4A、BCAR3和YWHAG在HCC組織中的水平較高，而RAB11A、GOT2、KDR、ATF3和SLC22A1在正常肝臟組織中的水平較高（圖1E）。通過熱圖可視化了22個(gè)HCC細(xì)胞系中14個(gè)ARPGs的表達(dá)水平。作者還通過qRT-PCR測(cè)試了兩個(gè)HCC細(xì)胞系的mRNA水平。從這兩個(gè)圖中可以看出，這些基因在HCC細(xì)胞中的表達(dá)水平是一致的。繪制了TCGA-LIHC隊(duì)列的熱圖，以測(cè)試腫瘤組織中14個(gè)ARPG的表達(dá)水平。
圖1 預(yù)后標(biāo)志物的構(gòu)建
2. 預(yù)后模型的驗(yàn)證
為了確認(rèn)結(jié)果，該模型還使用了一組獨(dú)立個(gè)體進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。Kaplan-Meier生存分析顯示，在TCGA訓(xùn)練樣本（圖2A）和GSE14520驗(yàn)證樣本（圖2B）中，低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的樣本的生存時(shí)間比高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的樣本更長(zhǎng)。ARPGs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在訓(xùn)練和驗(yàn)證過程中使用了時(shí)間相關(guān)的ROC曲線和曲線下面積（AUC）進(jìn)行了測(cè)試（圖2C、D）。在1年、3年和5年的時(shí)間點(diǎn)上，TCGA數(shù)據(jù)集的AUC曲線超過了0.76，GSE14520數(shù)據(jù)集的AUC曲線超過了0.63。這表明該模型在整個(gè)患者隨訪期間具有良好且穩(wěn)定的預(yù)測(cè)價(jià)值。隨后，作者根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)訓(xùn)練和驗(yàn)證集進(jìn)行了排名（圖2E、F）。結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的HCC患者的生存時(shí)間較差。
圖2
3. 通過該基因集的風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)
作者構(gòu)建了一個(gè)圖表，用來簡(jiǎn)單計(jì)算ARPG風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的十四個(gè)標(biāo)記物，并大致預(yù)測(cè)HCC的1年、3年和5年生存率（圖3A）。結(jié)果顯示，圖表預(yù)測(cè)的1年、3年和5年生存率與最佳預(yù)測(cè)性能非常接近（圖3B-D）。作者比較了正常組織和HCC組織中這14個(gè)ARPG的表達(dá)水平。箱線圖（圖3E）暗示它們也可能作為HCC的診斷生物標(biāo)志物。
圖3 在肝細(xì)胞癌(OS)預(yù)測(cè)中構(gòu)建一個(gè)刻度圖
4. 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組體細(xì)胞變異的比較
目前尚未發(fā)現(xiàn)可用作免疫療法敏感性預(yù)測(cè)分子的生物標(biāo)志物。腫瘤突變負(fù)荷（TMB）有潛力對(duì)免疫療法產(chǎn)生良好反應(yīng)。有研究顯示，與常規(guī)化療相比，高突變負(fù)荷的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，無論P(yáng)D-L1表達(dá)水平如何，一線奈伐單抗聯(lián)合伊匹單抗可延長(zhǎng)無進(jìn)展生存期（PFS）[9]。因此，突變?cè)蕉?，新抗原中有免疫原性的可能性就越高，這就是為什么T細(xì)胞會(huì)清除它們[10]。作者首先研究了肝癌中突變率最高的前八個(gè)基因在兩組之間的差異（圖4A）。變異分類也通過堆疊條形圖和箱線圖總結(jié)了變異類型和變異數(shù)量（圖4B）。在所有變異分類中，錯(cuò)義突變排名第一，而單核苷酸多態(tài)性（SNP）的發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他類型的突變?cè)贖CC中。通過小提琴圖，作者可以發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組的TMB數(shù)量高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖4C）。兩組之間的六個(gè)差異突變基因是CTNNB1、P53、TTN、ALB、MUC16和PCLO（圖4D）。在低風(fēng)險(xiǎn)組中，CTNNB1突變更為主導(dǎo)，并且一些研究表明CTNNB1突變的HCC具有良好的分化程度。TP53已被確定為HCC某些分子特征的生物標(biāo)志物和不利生存預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，根據(jù)作者的結(jié)果，高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體中TP53突變更為更常見（圖4D）。突變分析的數(shù)據(jù)表明，高風(fēng)險(xiǎn)患者可能更適合免疫治療。
圖4 分析不同風(fēng)險(xiǎn)組之間的體細(xì)胞變異
5. 分析模型的功能富集分析
將343個(gè)TCGA樣本根據(jù)其中位風(fēng)險(xiǎn)得分分為兩組。制作了一個(gè)火山圖，展示了這兩組之間的所有差異表達(dá)基因(DEGs)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高風(fēng)險(xiǎn)組中有1077個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，而有275個(gè)基因顯著下調(diào)(Figure 5A)。為了更好地了解14-ARPG的調(diào)控效應(yīng)，作者在Metascape中輸入了上調(diào)基因的前500個(gè)基因，獲得了一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。此外，作者從PPI網(wǎng)絡(luò)中提取了五個(gè)最有意義的MCODE組件(Figure 5B)，包括GPCR配體結(jié)合、snRNA加工和電壓門控鉀通道，這些與生物功能相關(guān)。為了探索與14-ARPG相關(guān)的潛在生物過程，作者使用這些前500個(gè)差異表達(dá)基因(Padj ≤ 0.05)進(jìn)行了GO分析(Figure 5C)。考慮到14基因標(biāo)志與一些重要的信號(hào)通路，作者應(yīng)用GSEA分析來尋找相關(guān)的通路。Reactome通路數(shù)據(jù)庫(kù)富集結(jié)果顯示，真核生物翻譯延伸、姐妹染色單體凝聚的解離、動(dòng)力蛋白、真核生物翻譯起始、前復(fù)制復(fù)合物的激活以及DNA解旋等通路富集顯著（圖5D）?？偨Y(jié)起來，作者發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間主要存在與細(xì)胞周期相關(guān)的生物差異。
圖5 ARPGs的相應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
6. 構(gòu)建基因特征標(biāo)志
根據(jù)上述研究，作者的模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與HCC患者的預(yù)后顯著相關(guān)。在HCC患者中，臨床因素如AJCC分期和年齡仍然是OS的重要預(yù)測(cè)因子。因此，作者將這些經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因素與作者的14-ARPG整合，制作了一張圖表，以開發(fā)一種有效的方法來預(yù)測(cè)HCC的OS（圖6A）。通過對(duì)這些變量的所有分?jǐn)?shù)求和，可以計(jì)算出患者的總體評(píng)分，基于此評(píng)分可以估計(jì)1年、3年和5年的存活率。作者還構(gòu)建了一條一年的ROC曲線，以比較作者的模型與其他傳統(tǒng)臨床數(shù)據(jù)（圖6B）。作者的模型的AUC為0.770，顯著高于其他模型。作者通過三個(gè)校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證了這個(gè)圖表，其中45°線代表最佳預(yù)測(cè)。校準(zhǔn)曲線表明，作者的圖表在1年、3年和5年的HCC OS預(yù)測(cè)方面表現(xiàn)良好（圖6C-E）。通過探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)，作者發(fā)現(xiàn)不同腫瘤分期的HCC患者之間的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分差異顯著（圖6F、G）。患有肝細(xì)胞癌的患者可以使用ARPGs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分來預(yù)測(cè)腫瘤的分期。
圖6 構(gòu)建預(yù)測(cè)預(yù)后的等高線圖
7. 不同群體對(duì)靶向治療和免疫療法的敏感性差異
在驗(yàn)證模型在預(yù)測(cè)診斷和預(yù)后方面的性能后，作者嘗試預(yù)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)患者的治療選擇。GSE109211包含了21個(gè)索拉非尼治療反應(yīng)者和46個(gè)接受索拉非尼治療但無反應(yīng)者，作者計(jì)算了他們的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分以檢查索拉非尼反應(yīng)是否與他們的風(fēng)險(xiǎn)特征有關(guān)。作者的模型中有8個(gè)基因在兩組之間表達(dá)差異明顯（圖7A）。此外，在索拉非尼治療反應(yīng)者中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著高于無反應(yīng)者（p ≤ 0.001）。這表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的肝細(xì)胞癌患者可能對(duì)索拉非尼更敏感（圖7B）。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效受表面表達(dá)水平的嚴(yán)格限制，因此作者使用TCIA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcia.at/home，于2022年1月1日訪問）分析了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果之間的關(guān)聯(lián)?；谒姆N免疫相關(guān)基因的免疫細(xì)胞組合開發(fā)的IPS在接受CTLA-4和PD-1抑制劑治療的患者中具有預(yù)測(cè)價(jià)值。低風(fēng)險(xiǎn)組的IPS和CTLA4評(píng)分顯著較高（p ≤ 0.05) 提供證據(jù)表明，具有低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的LIHC樣本可能適合免疫治療（圖7C，D）。
圖7 HCC患者治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)
8. 基于模型的潛在藥物預(yù)測(cè)
在下一步中，作者尋找可能適用于高風(fēng)險(xiǎn)患者的潛在藥物。通過DEPMAP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA隊(duì)列中的1448種化合物的AUC進(jìn)行估計(jì)后，作者對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和AUC進(jìn)行了相關(guān)性分析。然后，作者總結(jié)了與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈最強(qiáng)負(fù)相關(guān)的前十種化合物（圖8A）。Crizotinib是一種通過抑制間變性淋巴瘤激酶（ALK）和c-ros癌基因1（ROS1）來治療抗癌藥物，已經(jīng)獲得了治療非小細(xì)胞肺癌的批準(zhǔn)。作者還比較了不同組中Crizotinib預(yù)測(cè)AUC的分布，并發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)Crizotinib的整體敏感性更高（圖8B）。接下來，作者通過Transwell實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了Crizotinib在HUVECs中的抗遷移能力（圖8C）。作者觀察到Crizotinib降低了HUVECs的管狀形成能力（圖8D）。此外，Crizotinib還可以增加PLC/PRF/5和MHCC97H細(xì)胞系中的凋亡水平（圖8E）。然后，在C57小鼠中建立了皮下腫瘤模型，并用Crizotinib進(jìn)行治療。Crizotinib可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)速率和重量（圖9A、B）。皮下腫瘤的免疫組化染色顯示，增殖標(biāo)記物KI67和血管標(biāo)記物CD31在Crizotinib的作用下顯著受到抑制（圖9C）。
圖8 高風(fēng)險(xiǎn)群體潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)
圖9 活體內(nèi)對(duì)Crizotinib治療肝癌的實(shí)驗(yàn)
總結(jié)
總之，作者的研究確定了與血管生成相關(guān)的基因，這些基因?qū)τ诟渭?xì)胞癌的預(yù)后至關(guān)重要。此外，這個(gè)包含14個(gè)mRNA的預(yù)測(cè)標(biāo)志在不同亞型的患者中仍然具有顯著意義。這個(gè)模型似乎有助于肝細(xì)胞癌患者的個(gè)體化管理。
