01?Wnt信號通路

Wnt介導(dǎo)的信號在調(diào)控胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和細胞命運決定等多種細胞過程中的保守進化作用。Wnt信號通路包括Wnt配體、Frizzled受體（FZD家族）、共受體、β-Catenin降解復(fù)合物、β-Catenin/轉(zhuǎn)錄合作伴侶以及其他調(diào)控組分。Wnt是一種分泌的配體，通過其受體和下游效應(yīng)物傳導(dǎo)自分泌和旁分泌信號。Wnt配體/受體的細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)根據(jù)其對β-Catenin的依賴性被廣泛劃分為β-Catenin依賴信號（經(jīng)典Wnt信號）和β-Catenin非依賴信號（非經(jīng)典Wnt信號）。

1.1 Wnt配體和受體

哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19種分泌型Wnt配體和超過18種Wnt受體/共受體。

Wnt配體是一種脂質(zhì)修飾的糖蛋白。它的胞外分泌需要通過蛋白酯酰基轉(zhuǎn)移酶（PORCN）介導(dǎo)的蛋白?；ｕ；腤nt配體與Wntless結(jié)合，并從高爾基體轉(zhuǎn)運到細胞膜進行分泌。分泌的Wnt被FZD受體家族所識別后向胞內(nèi)傳導(dǎo)Wnt信號。

與FZD結(jié)合的LRP5/6是一種典型的共受體。

RNF43或ZNFR3是跨膜E3連接酶，通過降解FZD受體降解負調(diào)控Wnt信號。

R-spondins（RSPO1-4）是Wnt信號增強劑。R-spondins與LGR4-6和RNF43/ZNFR3復(fù)合物結(jié)合阻止了RNF43/ZNFR3介導(dǎo)的FZD的溶酶體降解，從而維持了Wnt信號傳導(dǎo)。

1.2 β-Catenin依賴信號

AXIN、APC、CK1、GSK3β和βTrCP組成β-Catenin降解復(fù)合物，它嚴(yán)格控制著細胞質(zhì)β-Catenin的水平。在沒有Wnt配體的情況下（Wnt off），降解復(fù)合物中的GSK3β和CK1磷酸化β-Catenin。磷酸化后的β-Catenin隨后由E3連接酶βTrCP泛素化并降解。在Wnt配體刺激下（Wnt on），AXIN與磷酸化的LRP5/6胞質(zhì)尾部和FZD受體適配蛋白Disheveled（Dvl）結(jié)合，Dvl負調(diào)控多亞基復(fù)合物對β-catenin的降解作用。這促進了β-catenin的累積和核轉(zhuǎn)位，與T細胞因子/淋巴樣增強因子?(TCF/LEF)等共激活因子相互作用，激活包括c-Myc、Axin2、CCND1和CD44等在內(nèi)的Wnt下游的靶基因轉(zhuǎn)錄。

1.3.?β-Catenin非依賴信號

在β-Catenin非依賴信號中，Wnt/受體相互作用的細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)主要通過如，RAC1-JNK、RHOA-ROCK和PLC-IP3-Ca2+進行的。

02?腫瘤中?Wnt信號的改變

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在腫瘤中，Wnt信號的遺傳改變主要表現(xiàn)在APC、ZNRF3、CTNNB1（編碼β-Catenin）、AXIN1和RSPOs等基因的突變。研究表明，抑制Wnt信號的過度活化已顯示出良好的抑制腫瘤效果。

2.1?腫瘤中Wnt信號傳導(dǎo)的變化

在結(jié)直腸癌（CRC）中，?APC的突變頻率約為60～80％，CTNNB1的突變頻率約為5～10％。APC和CTNNB1的突變通過穩(wěn)定β-Catenin引起Wnt信號過度激活，從而引發(fā)腸道腫瘤。

在胃癌（GC）中，檢測到13～22％的APC突變。APC突變足以在體內(nèi)模型中引發(fā)胃腫瘤，證明Wnt信號突變在GC發(fā)生過程中的驅(qū)動作用。另一個Wnt信號組分RNF43的突變在MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定）亞型（GC患者的約20％）中約為4.3％，在MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定）亞型（患者的約80％）中約為54.6％，也是關(guān)鍵的驅(qū)動突變。多個證據(jù)證明，Wnt信號在胃癌中既參與腫瘤驅(qū)動又促進腫瘤發(fā)展的作用。

在肝細胞癌（HCC）中，約50％的Wnt信號通路突變是激活突變。約20～25％的CTNNB1（編碼β-Catenin）、約10％的AXIN1和約3％的AXIN2發(fā)生突變。此外，F(xiàn)ZD3、FZD6和FZD7受體、Wnt 3、Wnt4、Wnt 5A配體以及調(diào)節(jié)因子RSPO2在HCC中過表達。這些Wnt信號的遺傳變異與肝細胞癌（HCC）的進展密切相關(guān)。

2.2?Wnt信號的改變促進腫瘤發(fā)展

除了Wnt信號的致癌作用外，特定腫瘤中的Wnt信號遺傳改變并不驅(qū)動腫瘤發(fā)生，起到促進腫瘤進展的作用。此外，支持腫瘤生態(tài)環(huán)境的Wnt信號對于促進各種原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的發(fā)展至關(guān)重要。

在肺癌中，Wnt信號的過度激活與腫瘤形成、復(fù)發(fā)和預(yù)后不良相關(guān)。在小細胞肺癌（SCLC）中，APC和CHD8的突變與SCLC的復(fù)發(fā)有關(guān)，CHD8抑制了由CTNNB1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。在非小細胞肺癌（NSCLC）中，Wnt配體（Wnt1、Wnt2、Wnt3和Wnt5a）和其他信號模塊（FZD8、PORCN和TCF-4）過表達。Wnt產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境對于肺腺癌的腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。

胰腺導(dǎo)管腺細胞癌（PDAC）中大約有4～10％的RNF43突變和<1％的APC和CTNNB1突變。Wnt信號的激活參與了胰腺腫瘤發(fā)生，抑制FZD和Wnt配體之間的相互作用可以阻止腫瘤發(fā)生。

03?Wnt信號在腫瘤中的靶向策略

Wnt異?；罨瘯l(fā)或促進腫瘤發(fā)生，因此，靶向?Wnt通路下調(diào)或恢復(fù)過度激活的Wnt信號可用于腫瘤的治療。

Wnt靶向策略可以分為四類：靶向Wnt配體、靶向Wnt受體、靶向降解復(fù)合物和靶向β-Catenin/轉(zhuǎn)錄因子。細胞外的Wnt配體和受體是特異抗體的良好靶點。然而，細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)組分無法通過抗體進行靶向。只有小分子化合物和肽段可用于靶向這些組分。因此，Wnt信號組分的酶活性區(qū)域是細胞內(nèi)組分的關(guān)鍵靶點。

3.1. 靶向Wnt配體

靶向特定的Wnt配體在特定的腫瘤類型中可以增加癌癥治療特異性。然而， Wnt配體和腫瘤類型的對應(yīng)關(guān)系仍然不明確，此外，在大多數(shù)情況下，Wnt信號中的突變主要發(fā)生在Wnt配體的下游，因此，靶向Wnt配體可能效果有限。

PORCN抑制劑LGK974（也稱為WNT974）通過抑制Wnt的?；^程，阻止Wnt的分泌，顯示出顯著抑制肺腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌進展的效果。其他PORCN抑制劑，如RXC004在胰腺癌異種移植瘤和胃癌PDX模型中抑制腫瘤生長。ETC-159抑制所有Wnt配體的分泌和活性。

可溶性FZD相關(guān)蛋白（SFRP）可以抑制Wnt信號通路。SFRP具有類似于FZD結(jié)構(gòu)域的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）。該結(jié)構(gòu)域作為SFRP與Wnt配體競爭性結(jié)合，以抑制Wnt信號。V3Nter是一種基于SFRP的多肽，能夠與Wnt3A結(jié)合并抑制結(jié)直腸癌中的Wnt信號。

DKK（Wnt調(diào)節(jié)因子）由五種類型組成，其中DKK1與LRP5/6結(jié)合，它是抑制經(jīng)典Wnt信號的調(diào)節(jié)因子，同時，DKK1也與激活非經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)。抑制DKK1能夠抑制多種癌癥的腫瘤發(fā)生。DKN-01是一種人源化抗體，能夠與DKK1結(jié)合，抑制癌癥的發(fā)展。

3.2. 靶向Wnt受體

細胞表面受體相對容易開發(fā)抗體，使Wnt受體成為有吸引力的藥物靶點。

OMP-18R5單克隆抗體（mAB）可結(jié)合五種FZD受體（FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8），并阻斷經(jīng)典Wnt通路。這種OMP-18R5單克隆抗體可以抑制結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺癌細胞的腫瘤生長。

OTSA-101是一種針對FZD10的單克隆抗體，正在進行肉瘤的一期臨床試驗。

OMP-54F28融合蛋白具有FZD8的細胞外N末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）。通過競爭性抑制FZD8，OMP-54F28抑制Wnt配體的信號傳導(dǎo)。

R-spondin可以誘導(dǎo)FZD受體的積累并增強Wnt信號傳導(dǎo)。因此，RSPO可能是Wnt信號的治療靶點。

OMP-131R10（Rosmantuzumab）是一種針對R-spondin 3（RSPO3）的單克隆抗體，已經(jīng)完成了針對晚期實體瘤或復(fù)發(fā)性腫瘤的一期臨床試驗。

3.3?靶向β-Catenin降解復(fù)合物

β-Catenin降解復(fù)合物（APC、CK1、AXIN和GSK3β等組成）在控制細胞質(zhì)和核β-Catenin濃度方面起著關(guān)鍵作用。因此，恢復(fù)降解復(fù)合物的功能或增強其功能對于癌癥治療是必要的。

CK1和GSK3β磷酸化β-Catenin，隨后誘導(dǎo)β-Catenin泛素化并降解。因此，激活CK1和GSK3β可以增強降解復(fù)合物的功能。

Pyrvinium是一種FDA批準(zhǔn)的藥物，它通過增強CK1激酶活性來抑制Wnt信號。

SSTC3是一種臨床前期的CK1小分子激活劑，其藥代動力學(xué)性能優(yōu)于現(xiàn)有的CK1激活劑。CCT031374是一種臨床前期的GSK3β激活劑，通過誘導(dǎo)野生型β-Catenin的降解來作為Wnt信號抑制劑。

Sulindac是一種FDA批準(zhǔn)的非甾體抗炎藥。Sulindac通過與Dvl的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷細胞膜上的降解復(fù)合物，從而抑制Wnt/β-Catenin通路。

增強降解復(fù)合物介導(dǎo)的β-Catenin降解的另一種方式是穩(wěn)定AXIN。

E7449是一種PARP（Poly（ADP-ribose）聚合酶）1/2和端錨聚合酶（TNKS）1/2抑制劑。端錨聚合酶屬于多聚ADP核糖聚合酶家族，能夠誘導(dǎo)AXIN的蛋白酶體降解。因此，抑制端錨聚合酶可以顯著增加AXIN蛋白的穩(wěn)定性。

H+-ATP酶（v-ATPase）介導(dǎo)溶酶體的囊泡酸化。溶酶體的酸化對于Wnt受體/共受體和APC的溶酶體降解是必需的，從而使Wnt/β-Catenin信號傳導(dǎo)過度激活。因此，v-ATPase抑制劑的可以抑制Wnt/β-Catenin信號傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生。

3.4. 靶向β-Catenin及其轉(zhuǎn)錄合作因子

β-Catenin通過與其轉(zhuǎn)錄合作因子TCF/LEF形成復(fù)合物而發(fā)揮作用。β-Catenin還招募cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CBP）和p300等共激活因子。這些因子的相互作用對于β-Catenin轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的完全激活至關(guān)重要。因此，阻斷這些相互作用可能是抑制Wnt信號的策略。

ICG-001及其類似物PRI-724干擾β-Catenin和CBP之間的相互作用。

BCL9的穩(wěn)定α螺旋（SAH-BCL9）可阻礙β-Catenin和轉(zhuǎn)錄共激活因子BCL9之間的相互作用。

維生素D3（1.25脫氫維生素D3）也破壞了-連環(huán)蛋白和TCF-4之間的相互作用。維生素D受體與其配體結(jié)合，并與TCF-4競爭結(jié)合-連環(huán)蛋白。因此，維生素D3作為補充劑參與了多項同化療的聯(lián)合治療臨床試驗。

04?靶向腫瘤Wnt信號通路的新策略

盡管Wnt靶向存在許多限制，但新的Wnt信號通路靶向藥物的臨床試驗也不斷涌現(xiàn)，例如DKK1和FZD靶向抗體等。

4.1?使用PROTAC/分子膠的Wnt信號通路靶向

4.1.1?PROTAC

PROTAC是由E3連接酶、感興趣的蛋白質(zhì)（POI）和能夠連接兩種配體的鏈接器組成的雙功能分子。E3連接酶對與PROTAC相互作用的POI進行泛素化，目標(biāo)蛋白質(zhì)最終通過蛋白酶體降解。

在使用PROTAC靶向Wnt中，β-Catenin是一個重要的細胞內(nèi)靶標(biāo)。xStAx-VHL是靶向β-Catenin的PROTAC，它由xStAx和VHLL組成。xStAx是一個與AXIN的β-Catenin結(jié)合域高度相似的肽，xStAx-VHL在細胞系和APC?/?類器官中誘導(dǎo)β-Catenin的劑量依賴性和持久性降解。

由于PROTAC不是基于平衡占位作用，因此其工作劑量非常低（nM濃度）。因此，與傳統(tǒng)的抑制劑相比，PROTAC具有低毒性和高選擇性的優(yōu)勢。

4.1.2? 分子膠

誘導(dǎo)或穩(wěn)定兩種不同蛋白質(zhì)之間的新相互作用的小分子稱為“分子膠”。與PROTAC相比，分子膠在分子量方面具有更多的優(yōu)勢。

通常情況下，突變的β-Catenin無法與天然的E3連接酶β-TrCP結(jié)合。然而，β-Catenin分子膠NRX-252114恢復(fù)了這種相互作用，并誘導(dǎo)突變的β-Catenin的蛋白酶體降解。

4.1.3? 其他蛋白質(zhì)降解技術(shù)

最近，出現(xiàn)了各種蛋白質(zhì)降解技術(shù)，例如PROTAB（蛋白質(zhì)降解靶向抗體）、AUTOTAC（自噬靶向融合體）和LYTAC（溶酶體靶向融合體）。這些新平臺未來可能在Wnt靶向癌癥治療中使用。

PROTAB是一種抗體，通過與跨膜E3連接酶ZNRF3結(jié)合來誘導(dǎo)細胞外靶受體的蛋白質(zhì)降解，ZNRF3是Wnt信號通路的負調(diào)控因子。雖然這種平臺并不直接靶向Wnt信號通路組分，但它可能適用于靶向Wnt通路的膜受體。

4.2. 基于抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）的Wnt信號靶向

ADC通過誘導(dǎo)與抗體結(jié)合的抗原表達細胞的凋亡來殺傷細胞。ADC結(jié)合了單克隆抗體和細胞毒性藥物的優(yōu)點，能夠更精確有效地靶向和消除靶細胞。

Septuximab vedotin（F7-ADC）是用于靶向FZD7的ADC。它包含人源FZD7抗體和微管抑制劑MMAE。卵巢漿液性囊腺癌過度表達Wnt受體FZD7， Septuximab vedotin（F7-ADC）在體外和體內(nèi)殺傷卵巢癌細胞而不產(chǎn)生毒性。

PTK7是Wnt配體的共受體。靶向PTK7適用于特異性靶向Wnt響應(yīng)的癌干細胞（CSCs）。PF-06647020是一種針對PTK7的ADC。PF-06647020能夠有效地傳遞抗癌藥物，并在各種癌細胞系和PDX（非小細胞肺癌、卵巢癌和三陰性乳腺癌）中顯示出抗癌效果。

LGR5靶向的ADC，LGR5–MC-vc-PAB–MMAE和LGR5–NMS818，LGR5靶向的ADC靶向表達LGR5的腫瘤干細胞。盡管這些ADC并不直接抑制Wnt信號通路，但它們能夠消滅Wnt響應(yīng)細胞（如CSCs）。此外，這些LGR5靶向的ADC能夠顯著抑制腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。

4.3. 寡核苷酸靶向的Wnt信號靶向

4.3.1. miRNA和siRNA

miRNA和siRNA由短序列組成，通過部分堿基配對靶向RNA。miR-15a和miR-16-1是腫瘤抑制因子，并在前列腺癌細胞中下調(diào)Wnt3a。

TargomiRs是包含miR-16基序列的微小RNA，有23個堿基對，靶向細胞表面的EGFR和Wnt3a。TargomiRs已經(jīng)在惡性胸膜間皮瘤和非小細胞肺癌的復(fù)發(fā)治療方面完成了臨床試驗。

Myc是β-Catenin依賴的Wnt通路的核心效應(yīng)蛋白。DCR-Myc是一種抗-Myc DsiRNA（Dicer基質(zhì)小干擾RNA），能夠在體內(nèi)抑制腫瘤生長。

4.3.2. 反義寡核苷酸

反義寡核苷酸（ASO）是由16-22個堿基組成的單鏈DNA類似物。ASO通過與靶向RNA序列結(jié)合并通過各種機制控制其表達。

LNA修飾的ASO是Wnt通路的間接靶向ASO。長鏈非編碼RNA（lncRNA）AC10401.1在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中高度表達，并與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。它在細胞質(zhì)中作為與miR-6817-3d的競爭性內(nèi)源性RNA，增加了Wnt2B的穩(wěn)定性，從而激活了經(jīng)典Wnt通路。此外，LNA修飾的ASO與Wnt信號抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可以抑制AC10401.1并抑制細胞系和患者源異種移植模型中的腫瘤細胞生長。因此，LNA-ASO有潛力通過靶向Wnt信號來抑制腫瘤發(fā)生。

2'-O-甲氧基乙基嵌合ASO可直接靶向β-Catenin。體內(nèi)研究數(shù)據(jù)也表明，2'-O-甲氧基乙基嵌合ASO可以特異性靶向β-Catenin。

05?展望

由于Wnt信號通路具有廣泛的生理功能，靶向Wnt可能導(dǎo)致治療的多種副作用。因此，近期的Wnt靶向方法側(cè)重于增加治療的特異性，減少副作用。

PROTAC/分子膠、ASO和ADC引入到Wnt靶向治療后，增加了靶向的特異性。這三種方法可幫助改善現(xiàn)有靶向策略的局限性。

藥物的研發(fā)在于不斷突破?；谛碌募夹g(shù)及對Wnt信號知識的積累，靶向Wnt信號通路的新腫瘤治療方法的出現(xiàn)是值得期待的。

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編譯自：

1.?New Wave of Targeting?‘Undruggable’? Wnt Signaling for?Cancer Therapy: Challenges and?Opportunities. Cells?2023,12,1110.?

2.https://bpsbioscience.com/research-areas/wnt-signaling-pathway

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