?細胞傳代

①細胞密度達到細胞瓶底面積的90%，且生長狀況良好，未被污染時，應(yīng)及時對細胞進行傳代。在超凈工作臺內(nèi)預(yù)先放入完全培養(yǎng)基、0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液、磷酸鹽緩沖溶液等，紫外照射消毒30?min。棄去培養(yǎng)基，向細胞瓶的側(cè)壁輕輕打入2?ml磷酸鹽緩沖溶液，注意不要直接沖擊生長貼壁細胞的細胞瓶底部，輕柔晃動細胞瓶，洗滌細胞表面，棄去培養(yǎng)基，該操作予以重復(fù)2次。

②吸凈殘留的磷酸鹽緩沖溶液，向細胞瓶的側(cè)壁或頂部輕輕打入1?ml的0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液，注意不要直接沖擊生長貼壁細胞的細胞瓶底部，輕柔晃動細胞瓶，確保0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液與細胞充分接觸，放入37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化，根據(jù)細胞的種類及生長狀況確定消化時間，在顯微鏡下觀察，確保細胞完全消化。

③棄去0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液，輕拍細胞瓶的側(cè)壁和頂部，使細胞更容易脫落，注意不要直接沖擊生長貼壁細胞的細胞瓶底部。向細胞瓶內(nèi)加入3 ml?含10% FBS的完全培養(yǎng)基，此時可以直接將培養(yǎng)基注入細胞瓶底部，使培養(yǎng)基與胰酶充分接觸，便于中和胰蛋白酶消化液。若胰蛋白酶消化液中脫落細胞較多，也可直接向細胞瓶內(nèi)加入3?ml的含10% FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。在燈光下一邊觀察細胞是否脫落，一邊吹打細胞瓶的各個角落，注意動作不可過于暴力，將瓶底部的細胞吹打沖洗下來，以免對細胞造成損害，將細胞懸液移入10?ml離心管。

④室溫800 rpm/min離心5 min，棄去殘留胰蛋白酶消化液的上清液，向離心管內(nèi)加入3 ml的含10% FBS的完全培養(yǎng)基，目的是使離心后聚集的成團細胞再次成為單個細胞，使完全培養(yǎng)基和離心管底部的細胞沉淀充分混勻，重懸至細胞分布均勻且為單個細胞。根據(jù)實驗需要將細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，根據(jù)實驗計劃和細胞種類確定傳代比例，補足細胞瓶內(nèi)培養(yǎng)基，標注傳代時間、細胞名稱、細胞代數(shù)、細胞瓶編號、實驗人員姓名等基本信息，放入37℃細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。次日顯微鏡下觀察細胞有無貼壁，生長狀況是否良好。

本人保留一切權(quán)利，以上實驗步驟僅供參考。