前言

種子發(fā)芽是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵階段。在氣候變化的情況下，種子將更頻繁地暴露在各種惡劣環(huán)境（高溫、干旱、洪水和鹽堿）和土傳播疾病中，這可能導(dǎo)致發(fā)芽減少和活力喪失，威脅種子發(fā)育并影響作物產(chǎn)量。因此，尋求提高種子抗逆能力的策略（在脅迫條件下快速發(fā)芽和建立幼苗）對(duì)于保持作物產(chǎn)量至關(guān)重要。

2023年1月10日，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院趙麗娟研究團(tuán)隊(duì)在ACS Nano期刊（?IF:18.027）發(fā)表了題為“AgNPs-Triggered Seed Metabolic and Transcriptional Reprogramming Enhanced Rice Salt Tolerance and Blast Resistance”的研究成果，文章采用多組學(xué)（代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）聯(lián)合研究方法，研究銀納米顆粒（AgNPs）在對(duì)種子進(jìn)行預(yù)刺激后，探索種子應(yīng)激恢復(fù)力的影響。結(jié)果表明，AgNPs啟動(dòng)觸發(fā)了水稻種子中的代謝和轉(zhuǎn)錄重編程，激活應(yīng)激信號(hào)和防御相關(guān)通路，并啟動(dòng)了應(yīng)激/免疫反應(yīng)。促進(jìn)種子在脅迫條件下更快，更好地發(fā)芽，提高幼苗對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗力。文章提出的基于納米生物刺激劑的策略有望促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)。

中文標(biāo)題：?AgNPs誘發(fā)的種子代謝和轉(zhuǎn)錄重編程增強(qiáng)水稻抗鹽性和抗瘟性

研究對(duì)象：水稻

發(fā)表期刊：ACS Nano

影響因子：18.027

發(fā)表時(shí)間：2023年01月10日

合作單位?:?南京大學(xué)

運(yùn)用組學(xué)技術(shù)：GC-MS非靶向代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)

研究背景

植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的防御系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)各種非生物和生物脅迫，這種能力可以通過壓力/免疫刺激來(lái)增強(qiáng)。使用預(yù)刺激，可以預(yù)先調(diào)節(jié)植物非生物脅迫/免疫系統(tǒng)，從而在隨后的非生物和生物脅迫下更快，更強(qiáng)烈地激活防御反應(yīng)。

銀納米顆粒（AgNPs）已被證明可以催化ROS的產(chǎn)生，?所以AgNPs被選為納米生物刺激劑來(lái)啟動(dòng)種子防御系統(tǒng)。此外，水稻作為世界各地的主要食物來(lái)源，極易受到鹽脅迫的影響，尤其是在幼苗早期。因此，選擇水稻和鹽脅迫作為植物和非生物脅迫條件。

作者證明AgNPs可以被種子吸收，隨后在種子中觸發(fā)代謝和轉(zhuǎn)錄組重編程。負(fù)責(zé)應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)的特殊代謝物的水平在AgNPs干預(yù)后增加。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，AgNPs激活信號(hào)傳導(dǎo)和防御相關(guān)基因表達(dá)，表明應(yīng)激/免疫反應(yīng)的激活。重要的是，這種“壓力記憶”可以持續(xù)到幼苗階段，表明種子防御-啟動(dòng)能夠同時(shí)增加幼苗對(duì)非生物和生物脅迫的抵抗力?？偟膩?lái)說(shuō)，這種簡(jiǎn)單的基于納米生物刺激劑的策略可能有助于設(shè)計(jì)氣候適應(yīng)型作物。

研究思路

研究結(jié)果

1.?鹽脅迫下AgNPs預(yù)處理種子增強(qiáng)種子活力

為了測(cè)試AgNPs是否可以在發(fā)芽階段增加耐鹽性，在沒有AgNPs的情況下,暴露于鹽中的水稻種子在發(fā)芽速度，發(fā)芽百分比，幼苗活力指數(shù)，生物量和根長(zhǎng)方面表現(xiàn)出顯著降低（圖1A-F），證明了對(duì)鹽脅迫的敏感性。相比之下，用AgNPs預(yù)灌水的水稻種子具有更快的種子發(fā)芽速度，增加發(fā)芽率，種子活力指數(shù)，增加生物量和根長(zhǎng)（圖1A-F）。這些結(jié)果驗(yàn)證了AgNPs引發(fā)可以增強(qiáng)水稻種子耐鹽性的假設(shè)。這些結(jié)果顯示，使用AgNPs作為納米生物刺激劑在不利條件下提高種子性能的巨大潛力，而潛在的機(jī)制仍有待完全闡明。

圖1 |?AgNPs啟動(dòng)可增強(qiáng)鹽脅迫條件下種子的萌發(fā)和活力?

a) 7日齡水稻幼苗的代表性圖像；

b)?發(fā)芽速度；

c)?發(fā)芽率；

d)?種子活力；

e)?生物量；

F) 根長(zhǎng)；

2.?AgNPs在干預(yù)過程中進(jìn)入種子

推測(cè)AgNPs增強(qiáng)種子對(duì)鹽脅迫耐受性的機(jī)制是由AgNPs觸發(fā)的“防御啟動(dòng)”效應(yīng)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先測(cè)試了AgNPs在啟動(dòng)過程中是否以及如何進(jìn)入種子。將用AgNPs引發(fā)24 h的水稻種子徹底洗滌并分成三個(gè)隔室（種皮，胚胎和胚乳），并通過ICP-MS進(jìn)行銀含量分析。結(jié)果表明，在種子的所有組織中均檢測(cè)到Ag（圖2A）。表明AgNPs（或Ag離子）可以穿透種皮并進(jìn)入種子組織。SP-ICP-MS的結(jié)果進(jìn)一步表明，種子中的所有Ag均為納米顆粒形式（圖2B），表明納米顆粒Ag而不是電離的Ag進(jìn)入種子（圖 2F）。

3.?種子中的AgNPs催化ROS生產(chǎn)

接下來(lái)，為驗(yàn)證種子中的AgNPs是否可以催化ROS的產(chǎn)生。使用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）作為熒光探針，分別通過熒光顯微鏡和生物閱讀器可視化和定量水稻種子中的ROS。熒光顯微鏡圖像顯示，與水啟動(dòng)相比，AgNPs引發(fā)明顯增加種子ROS水平，特別是在胚胎組織中（圖2C）。這些結(jié)果表明，AgNPs提高了水稻種子的ROS產(chǎn)量。體外納米酶測(cè)定發(fā)現(xiàn)AgNPs可以在酸性條件下在H2O2存在下催化TMB（3，5，3′，5′-四甲基聯(lián)苯胺，底物）的氧化（圖2D）。通過使用電子順磁共振（EPR）波譜，作者進(jìn)一步證實(shí)了AgNPs產(chǎn)生的ROS物種是OH?（圖2E）。綜上所述，結(jié)果表明AgNPs能夠參與H2O2催化和OH?生成。因此，細(xì)胞中的AgNPs可能模仿POD酶的功能，調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)。

圖2 |?在AgNPs啟動(dòng)過程中，種子中AgNPs和AgNPs增強(qiáng)ROS的吸收?

a)?用AgNPs灌注24 h后水稻種子不同組織（種皮，胚胎和胚乳）中的銀分布；

b)?用AgNPs引發(fā)24小時(shí)的水稻種子中納米顆粒Ag的大小分布；

c)?使用熒光（左）和明場(chǎng)（右）顯微鏡捕獲的水或AgNPs引發(fā)的水稻種子的圖像；

d) AgNPs的類似POD的活動(dòng)；

EPR結(jié)果顯示羥基自由基（OH?）的產(chǎn)生；

4.?AgNPs引發(fā)的水稻種子的代謝變化

羥基自由基被稱為信號(hào)分子，在促進(jìn)發(fā)芽、免疫反應(yīng)和適應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用。AgNPs可能作為激活應(yīng)激/免疫反應(yīng)的警告信號(hào)，包括防御相關(guān)基因和代謝物的激活。因此，接下來(lái)使用多組學(xué)分析（代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）表征了AgNPs觸發(fā)的種子分子變化。

首先，使用基于GC-MS非靶向代謝組學(xué)測(cè)定AgNPs或水干預(yù)24 h的水稻種子中代謝物。如圖3A所示，OPLS-DA評(píng)分圖表明兩組之間有明顯的分離。這表明AgNPs-啟動(dòng)在啟動(dòng)24小時(shí)內(nèi)顯著改變了水稻種子的代謝物譜。換句話說(shuō)，AgNPs引發(fā)導(dǎo)致水稻種子中的代謝重編程。

AgNPs增加了參與應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的幾種代謝物的水平。例如，水楊酸（SA）是一種信號(hào)分子，可激活對(duì)非生物和生物脅迫的防御反應(yīng)，AgNPs的種子中證明了SA水平的增強(qiáng)（圖3C）。SA在建立系統(tǒng)性獲得性耐藥性（SAR）中起重要作用。因此，ROS觸發(fā)的SA上調(diào)可能是促進(jìn)水稻種子發(fā)芽和耐鹽性的原因。綜上所述，這些信號(hào)分子的上調(diào)可能是AgNPs啟動(dòng)觸發(fā)水稻種子免疫反應(yīng)的有力指標(biāo)?？傊?，這些結(jié)果表明，24小時(shí)的AgNPs引發(fā)在水稻種子中引起了顯著的代謝重編程。

圖3 |?用AgNPs引發(fā)水稻種子的代謝變化

a)?基于用水（水底漆）或AgNPs灌注的水稻種子代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集的OPLS-DA評(píng)分圖；

b) OPLS-DA VIP評(píng)分圖，顯示導(dǎo)致分離的代謝物；

c)?箱線圖表示用40mg / LAgNPs處理的水稻種子中顯著變化的代謝物（通過t檢驗(yàn)篩選）的相對(duì)豐度，藍(lán)色、粉紅色、黃色和紫色意味著糖、抗氧化劑、莽草酸途徑中間體和信號(hào)代謝物。

5.?AgNPs引發(fā)的水稻種子的轉(zhuǎn)錄變化

代謝組學(xué)分析揭示了AgNPs引發(fā)的水稻種子中的一些關(guān)鍵分子事件，這可以部分解釋水稻種子耐鹽性增強(qiáng)的原因。接下來(lái)使用轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序（RNA-seq）分析了AgNPs引發(fā)的水稻種子的轉(zhuǎn)錄組，以揭示更多負(fù)責(zé)增強(qiáng)水稻種子耐鹽性的分子事件。RNA測(cè)序表明在AgNPs啟動(dòng)過程中水稻種子的轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)生顯著改變。此外，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的通路分析顯示，多達(dá)20條通路上調(diào)（圖4）。這表明ROS作為外部信號(hào)在水稻種子中誘導(dǎo)了明顯的防御反應(yīng)，這證實(shí)了上述基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的假設(shè)。

應(yīng)激反應(yīng)由受體激活和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)引發(fā)。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在用AgNPs引發(fā)的水稻種子中，許多與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因上調(diào)（圖5）。AgNPs引發(fā)的種子中CDPK和鈣調(diào)蛋白相關(guān)鈣傳感器蛋白的上調(diào)在AgNPs引發(fā)的水稻種子中很明顯（圖5A）。上述結(jié)果表明，ROS可以與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（如CDPK，MAPK和激素）相互作用，以響應(yīng)AgNPs增強(qiáng)的ROS。

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子（TF）的調(diào)節(jié)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。因此，TFs作為信號(hào)傳導(dǎo)的終點(diǎn)和基因調(diào)控的起點(diǎn)，在植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。AgNPs引發(fā)的種子顯示出幾種TF的增強(qiáng)表達(dá)（圖5B）。因此，這些防御相關(guān)TF的改變可能有助于增強(qiáng)水稻種子的耐鹽性。

對(duì)于參與AgNPs引發(fā)的水稻種子防御反應(yīng)的基因。AgNPs上調(diào)了熱休克蛋白（HSP）的基因表達(dá)（圖5C）。植物HSP作為分子伴侶，在保護(hù)其他蛋白質(zhì)免受應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷（如展開和聚集）方面發(fā)揮著重要作用。綜上所述，水稻種子中這些防御相關(guān)基因的上調(diào)可能表明AgNPs引發(fā)水稻種子的防御反應(yīng)。

圖6總結(jié)了AgNPs引發(fā)促進(jìn)水稻種子萌發(fā)和增強(qiáng)抗逆性的可能分子機(jī)制。在AgNPs啟動(dòng)過程中，AgNPs首先促進(jìn)了ROS的上調(diào)，隨后觸發(fā)了信號(hào)通路的上調(diào)并激活了防御基因。?

圖4 |?由AgNPs啟動(dòng)誘導(dǎo)的水稻種子中上調(diào)DEG（差異表達(dá)基因）的富集KEGG途徑

圖5?|?用AgNPs引發(fā)的水稻種子中差異表達(dá)基因的熱圖?

a)?激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因;

b)?轉(zhuǎn)錄因子（TF）基因;

TF靶向負(fù)責(zé)防御和加速種子萌發(fā)的基因;

圖6 ?|??AgNPs引發(fā)增強(qiáng)水稻種子萌發(fā)和抗逆作用機(jī)理示意圖

6.?“壓力記憶”的持續(xù)時(shí)間

AgNPs觸發(fā)脅迫/免疫反應(yīng)增強(qiáng)了水稻種子的脅迫耐受性。對(duì)AgNPs啟動(dòng)誘導(dǎo)的“壓力記憶”的持續(xù)時(shí)間值得探究。因此，通過實(shí)驗(yàn)表明AgNPs引發(fā)的水稻種子在非脅迫條件下生長(zhǎng)4周，然后暴露于鹽3天。研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs引發(fā)顯著緩解了鹽誘導(dǎo)的水稻幼苗生長(zhǎng)抑制（圖7A，B）。這些結(jié)果表明，AgNPs啟動(dòng)觸發(fā)的“壓力記憶”可以持續(xù)數(shù)周。AgNPs引發(fā)顯著使葉片MDA含量降低（圖7C）。此外，水稻葉子的總抗氧化能力增加（圖7D）。這些數(shù)據(jù)表明，即使在種子灌注一個(gè)月后，水稻幼苗的一般氧化還原能力也有所增加。

圖7 ?|??AgNPs種子啟動(dòng)對(duì)水稻幼苗耐鹽性能

7.?AgNPs-啟動(dòng)增強(qiáng)水稻抗瘟病性能

在植物中，ROS在非生物和生物脅迫傳感中都起著至關(guān)重要的作用。繼續(xù)用實(shí)驗(yàn)測(cè)試AgNPs啟動(dòng)是否可以抑制水稻病原體。將4周齡水稻幼苗的分離水稻葉滴接種米粒分生孢子菌分生孢子懸浮液。接種后7天，所有測(cè)試的葉片中都出現(xiàn)疾病癥狀（棕色病病變）（圖8A）。然而，用AgNPs預(yù)處理的水稻幼苗的病變大小遠(yuǎn)小于對(duì)照葉片（圖8B）。這些結(jié)果表明，AgNPs引發(fā)對(duì)稻瘟病的侵染有中度抑制作用，但不能完全抑制稻瘟病侵染。因此，推測(cè)水稻葉片的抗病能力來(lái)自啟動(dòng)觸發(fā)的應(yīng)激/免疫反應(yīng)（“應(yīng)激記憶”），而不是AgNPs本身的抗菌活性。

圖8 | 分離葉測(cè)定 （DLA） 的結(jié)果?

a)?代表性圖像顯示，與對(duì)照（加氫灌注）相比，AgNPs種子灌注后葉瘟病敏感性降低;

b)?稻瘟疫感染稻葉的病變大小;

相關(guān)討論

這項(xiàng)研究表明，用ROS增強(qiáng)AgNPs預(yù)處理的水稻種子不僅可以在鹽條件下更快，更好地種子發(fā)芽，還可以保護(hù)幼苗免受未來(lái)的非生物（鹽）和生物脅迫（稻瘟病真菌）的影響。

組學(xué)的應(yīng)用能夠闡明增強(qiáng)抗性的分子機(jī)制。信號(hào)和防御相關(guān)代謝物和基因的上調(diào)表明種子啟動(dòng)觸發(fā)應(yīng)激/免疫反應(yīng)，從而能夠?qū)ξ磥?lái)的應(yīng)激做出快速而強(qiáng)烈的防御反應(yīng)。納米生物刺激劑就像植物“疫苗”。獲得的“免疫力”已經(jīng)持續(xù)數(shù)周，但這種影響是否會(huì)持續(xù)數(shù)月，甚至持續(xù)到下一代，仍然未知。

此外，由于觸發(fā)的全身抗性，這種“疫苗”可能會(huì)賦予水稻幼苗免受廣譜病原體和多種非生物脅迫（例如干旱、熱、冷、倒伏）的保護(hù)。此外，在其他生長(zhǎng)階段，種子灌注與全株灌漆（葉面噴灑或根部灌溉）相結(jié)合可能會(huì)增強(qiáng)保護(hù)作用，這也值得在未來(lái)的研究中嘗試。這是一種設(shè)計(jì)氣候適應(yīng)型工廠的簡(jiǎn)單而有效的策略，可以為氣候變化引起的糧食不安全問題提供可持續(xù)的解決方案。

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本研究采用多組學(xué)（代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）技術(shù)，表征了AgNPs引發(fā)的水稻種子的轉(zhuǎn)錄變化和水稻種子的代謝變化，提示AgNPs啟動(dòng)觸發(fā)水稻種子中的代謝和轉(zhuǎn)錄重編程，通過多組學(xué)分析技術(shù)挖掘潛在機(jī)制通路。為文章增添風(fēng)采，值得借鑒。

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