實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

1、了解誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的基本原理；

2、學(xué)習(xí)和掌握誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的常用方法；

3、誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，為后續(xù)SDS-PAGE和蛋白純化實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

實(shí)驗(yàn)原理：

基因工程的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)內(nèi)，使外源基因高效表達(dá)，從而產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。外源基因在宿主菌中的表達(dá)就是使克隆在表達(dá)載體上的外源基因在宿主菌中以發(fā)酵的方式快速、高效的合成基因產(chǎn)物。

通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中，因?yàn)槟承┯袃r(jià)值的外源蛋白質(zhì)可能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白質(zhì)的過(guò)量表達(dá)必將影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，而細(xì)胞代謝的損傷又必然影響外源基因的表達(dá)。因此，合理的調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，是提高外源基因表達(dá)水平的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。所以，在基因表達(dá)過(guò)程中，宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)是分成兩個(gè)階段進(jìn)行的，第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞快速生產(chǎn)，以獲得足夠量的細(xì)胞；第二階段是啟動(dòng)調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，使所有的細(xì)胞的外源基因同時(shí)高效表達(dá)，以產(chǎn)生大量基因表達(dá)產(chǎn)物。這是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷最常用的方法。

本實(shí)驗(yàn)中使用pEasy-Blunt E1表達(dá)載體（見(jiàn)圖1）含有T7啟動(dòng)子和Olac操縱元件，編碼與T7啟動(dòng)子結(jié)合的T7 RNA聚合酶的基因位于宿主細(xì)胞BL21(DE3）內(nèi)，該基因受Lac UV5啟動(dòng)子控制。在無(wú)IPTG等誘導(dǎo)的時(shí)候，T7 RNA聚合酶的編碼基因不表達(dá)，無(wú)T7 RNA聚合酶產(chǎn)生；無(wú)T7 RNA聚合酶與T7啟動(dòng)子結(jié)合，外源基因不表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)材料：

1、菌株：陽(yáng)性克隆子大腸桿菌BL21（DE3）（pEasy-Blunt E1：gfp）（實(shí)驗(yàn)七驗(yàn)證）

2、試劑：LB培養(yǎng)基，IPTG

3、實(shí)驗(yàn)器具：振蕩搖床，紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、將陽(yáng)性克隆子大腸桿菌BL21（DE3）（pEasy-Blunt E1：gfp）接種于含AMP（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm 培養(yǎng)過(guò)夜；

2、以1%的接種量將培養(yǎng)物接種于50ml含AMP（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中（50mL培養(yǎng)基，250mL三角瓶），37℃ 250rpm以上轉(zhuǎn)速培養(yǎng)至OD600為0.5；

3、在三角瓶中加入250μL IPTG（200μM），使IPTG濃度至1μM，誘導(dǎo)表達(dá)3-5h；

4、收獲菌體，用于后續(xù)SDS-PAGE鑒定。

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