實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

1、掌握PCR擴(kuò)增驗(yàn)證陽性克隆子的原理和方法

2、熟練掌握PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)驗(yàn)一中的DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平末端產(chǎn)物（由gfpf和gfpr引物擴(kuò)增所得），與其對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)二中使用的載體pEasy-Blunt E1為線性化的平末端載體（插入位點(diǎn)兩側(cè)分別有T7啟動(dòng)子引物（T7P）和T7終止子引物（T7T），兩者連接有兩種不同的重組方式（見圖2），A圖中g(shù)fp基因正確插入，gfp基因的編碼鏈與載體編碼鏈位于同一條DNA單鏈上，gfp基因可以正確表達(dá)；B圖中g(shù)fp基因錯(cuò)誤插入，gfp基因不能正確表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)六提前的質(zhì)粒為模板，使用T7T和gfpf為引物，通過PCR的方法驗(yàn)證正確插入的克隆子。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后能擴(kuò)增出產(chǎn)物的為重組方式正確的克隆，反之為錯(cuò)誤重組方式的克隆。

實(shí)驗(yàn)材料：

1.?試劑：Taq DNA 聚合酶；10mM dNTPs；實(shí)驗(yàn)六提取的質(zhì)粒；引物(T7T、gfpf）；0.8% 瓊脂糖凝膠；1×電泳緩沖液。

2.?實(shí)驗(yàn)器具：PCR儀，凝膠成像儀，電泳儀。

實(shí)驗(yàn)步驟：

按照下表配制PCR反應(yīng)Mixture，每個(gè)反應(yīng)體系25μl。

2.PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序見下表：

3.?瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。