實驗目的

1.?掌握堿變性法提取質(zhì)粒的原理

2.?掌握質(zhì)粒提取的方法步驟

實驗原理

在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為：松弛線性的DNA；松弛開環(huán)的OC構(gòu)型；超螺旋的SC構(gòu)型。道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA則位于凝膠的最后邊；道中的L DNA 在凝膠中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之間。

實驗材料

1、菌株：大腸桿菌BL21（DE3）（已轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pEasy E1-gfp）；

2、試劑：0.8%瓊脂糖凝膠；

3、實驗器具：離心機，電泳儀，凝膠成像儀。

實驗步驟

1、取1.5ml培養(yǎng)液，8000g離心3min，收集菌體；

2、加入250μl溶液I，充分懸浮菌體；

3、加入250μl溶液II，溫和上下翻轉(zhuǎn)4-6次，使菌體充分裂解，直至溶液變透明粘稠。裂解時間不能超過5min；

4、加入350μl溶液III，溫和上下翻轉(zhuǎn)，充分混勻。13000g離心10min；

5、將吸附柱放入收集管中，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱，12000g離心30sec，倒掉濾液

6、向吸附柱中加入500μl去蛋白溶液，12000g離心30sec，倒掉濾液；

7、向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000g離心30sec，倒掉濾液；

8、重復步驟7一次；

9、吸附柱12000g離心2min，去除殘留漂洗液；

10、取出吸附柱放入一個新的1.5ml離心管，向吸附柱中央滴加50-100μl洗脫液EB，12000g離心一分鐘洗脫DNA；

11、瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒提取效果。