分子生物學(xué)重點(diǎn)（考試必備）

1 分子生物學(xué)：是一門從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。

2 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)：是分子生物學(xué)的一個(gè)重要分支，又是一門新興交叉學(xué)科。它是從分子水平上研究人體在正常和疾病狀態(tài)下的生命活動(dòng)及其規(guī)律，從分子水平開展人類疾病的預(yù)防、診斷和治療研究的一門科學(xué)。

3酶工程：過去主要是通過生物化學(xué)方法從各種材料中提取、制備酶制劑?，F(xiàn)在主要應(yīng)用基因工程技術(shù)制取酶制劑。

4蛋白質(zhì)工程：過去主要是采用化學(xué)方法對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備出有特定功能的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在主要應(yīng)用基因工程技術(shù)，從改造目的基因的結(jié)構(gòu)入手，在受體細(xì)胞中表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

5微生物工程：又稱發(fā)酵工程是利用微生物特定性狀，使微生物產(chǎn)生有用物質(zhì)或直接用于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。

6DNA的甲基化：DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個(gè)甲基而被修飾，稱為DNA的甲基化。

7 CG島：在整個(gè)基因組中存在一些成簇、穩(wěn)定的非甲基化CG，這類CG稱為CG島。

8 信使RNA：從DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA分子中，有一類可作為蛋白質(zhì)生物合成的模板，稱為信使RNA。

9 順反子：由結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成的RNA序列亦稱為順反子。

10 帽子結(jié)構(gòu)：5端第1個(gè)核苷酸是甲基化鳥嘌呤核苷酸，它以5端三磷酸酯鍵與第2個(gè)核苷酸的5端相連，而不是通常的3、5磷酸二酯鍵。

11 核酶：在沒有任何蛋白質(zhì)（酶）存在的條件下，某些RNA分子也能催化其自身或其它RNA分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，即某些RNA具有酶樣的催化活性，這類具有催化活力的RNA被命名為核酶。

12 蛋白質(zhì)的變性：蛋白質(zhì)分子愛到物理化學(xué)因素（如加熱、紫外線、高壓、有機(jī)溶劑、酸、堿等）的影響時(shí)，可使維持空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，性質(zhì)改變，生物活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。

13：蛋白質(zhì)的復(fù)性：導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素除去后，某些蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)天然構(gòu)象，表現(xiàn)出天然蛋白質(zhì)的生物活性，稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。

14 基因：是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。

15 基因組：細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和稱為基因組。

16 操縱子：是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子。

轉(zhuǎn)錄單位：儲(chǔ)存ＲＮＡ和蛋白質(zhì)肽鏈序列信息的結(jié)構(gòu)基因與指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始部位的序列（啟動(dòng)子）和轉(zhuǎn)錄終止的序列（終止子）共同組成轉(zhuǎn)錄單位。

17 啟動(dòng)子：是RNA聚合酶結(jié)合的區(qū)域，操縱基因?qū)嶋H上不是一個(gè)基因，而是一段能被特異阻遏蛋白識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。

18 質(zhì)粒：是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的DNA分子，是共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。

19 質(zhì)粒的不相容性：具有相同復(fù)制起始位點(diǎn)和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個(gè)宿主菌，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。

20 轉(zhuǎn)位因子：即可移動(dòng)的基因成分，是指能夠在一個(gè)DNA分子內(nèi)部或兩個(gè)DNA分子之間移動(dòng)的DNA片段。

20自私DNA：核生物基因組中也存在一些可移動(dòng)的遺傳因素，這些DNA順序并無明顯生物學(xué)功能，似乎為自己的目的而組織，故有自私DNA之稱。

21 自殺基因：將某些細(xì)菌、病毒和真菌中特異性的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，此基因編碼的特異性酶類能將原先對(duì)細(xì)胞無毒或毒性極低的前體物質(zhì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成毒性物質(zhì)，達(dá)到殺死腫瘤的目的，這類前體轉(zhuǎn)移酶基因稱為——

22 斷裂基因：真核生物的結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)的，編碼氨基酸的序列被非編碼序列所打斷，因而被稱為——在編碼序列之間的序列稱為內(nèi)含子，被分隔開的編碼序列稱為外顯子。

23 順式調(diào)控元件（順式作用元件）：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。

24 反式作用因子：一些蛋白質(zhì)因子可通過結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，這些蛋白質(zhì)因子稱為反式作用因子。

真核細(xì)胞內(nèi)含有大量的序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因開放或關(guān)閉，稱為反式作用因子，簡稱反式因子。

25 啟動(dòng)子：是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。

26 上游啟動(dòng)子元件：是TATA盒上游的一些特定的DNA序列，反式作用因子可與這些元件結(jié)合，通過調(diào)節(jié)TATA因子與TATA盒的結(jié)合、RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成（轉(zhuǎn)達(dá)錄起始因子與RNA聚合酶結(jié)合）來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。

27 反應(yīng)元件：一些信息分子的受體被細(xì)胞外信息分子激活后，能與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。這種特異的DNA序列實(shí)際上也是順式元件，由于能介導(dǎo)基因?qū)?xì)胞外的某種信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，被稱為反應(yīng)元件。

28 增強(qiáng)子：是一段DNA序列，其中含有多個(gè)能被反式作用因子識(shí)別與結(jié)合的順式作用元件。

29 負(fù)增強(qiáng)子（沉默子）；增強(qiáng)子內(nèi)含負(fù)調(diào)控序列，稱為——

30 基因家族：指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。

31 基因超家族：是指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族。

32 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：真核生物中一些中度重復(fù)序列的轉(zhuǎn)移成分則與一般細(xì)菌中的轉(zhuǎn)移成分不同，要先轉(zhuǎn)錄成RNA，再逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后重新整合到基因組中，這種逆轉(zhuǎn)錄旁路的轉(zhuǎn)移成分稱為——

33 端粒：以線性染色體形式存在的真核基因組DNA的末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)，稱——，功能主要有保護(hù)線性DNA的完整復(fù)制，保護(hù)染色體末端及決定細(xì)胞的壽命等。

34 反向重復(fù)順序：是指兩個(gè)順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。其中一種形式是兩個(gè)拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔順序，這種結(jié)構(gòu)亦稱回文結(jié)構(gòu)。

35 RFLP技術(shù)：通過限制酶酶切片段的長度多態(tài)性來揭示DNA堿基組成不同的技術(shù)稱為限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，簡稱——。

36 遺傳圖：又稱連鎖圖，是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記作為“位標(biāo)”遺傳學(xué)距離為“圖標(biāo)”的基因組圖。

37 物理圖：是以一段已知核苷酸序列的DNA片段為“位標(biāo)”，以DNA實(shí)際長度（Mb或kb）作為圖距的基因組圖。

３８　光修復(fù)：生物體內(nèi)有一種光復(fù)活酶，被光激活后能利用光反提供的能量使紫外線照射引起的嘧淀二聚體分開，恢復(fù)原來的兩個(gè)核苷酸，稱為光修復(fù)。

３９　逆轉(zhuǎn)錄：是指以ＲＮＡ為模板，利用宿主細(xì)胞中４種dＮＴＰ為原料，在引物的３端以５－３方向合成與ＲＮＡ互補(bǔ)的ＤＮＡ鏈的過程，此過程與中心法則方向相反，故稱為——

４０　SD序列：AUG密碼子上游8~13個(gè)堿基處存在一個(gè)稱為SD序列的結(jié)構(gòu)，該序列與小亞基中16SrRNA3端的序列互補(bǔ)，當(dāng)mRNA與小亞基結(jié)合時(shí)，SD序列與16SrRNA3端互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，起始密碼準(zhǔn)確的定位于翻譯起始部位。

41 基因表達(dá)：是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。

41a a基因工程：將基因進(jìn)行克隆，并利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為——

41b分子克隆：制備DNA片段，并通過載體將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得單一DNA分子的大量拷貝。

42 DNA重組：不同來源的DNA分子可以通過末端共價(jià)連接（磷酸二酯鍵）而形成重新組合的DNA分子。這一過程稱為——

43管家基因：有些在生命全過程都是必需的，且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因，通常被稱為——

44誘導(dǎo)表達(dá)：有些基因表達(dá)極易愛環(huán)境變化影響，在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，有些基因的表達(dá)表面為開放或增強(qiáng)，則這種表達(dá)方式稱為——

45 嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)：細(xì)菌在缺乏氨基酸的環(huán)境中，RNA聚合酶活性降低，RNA（rRNA,tRNA）合成減少或停止，這種現(xiàn)象稱為——

46 衰減子：細(xì)菌中的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯合成是偶聯(lián)在一起的。這一特點(diǎn)使細(xì)菌的一些操縱子的特殊序列可以在轉(zhuǎn)錄過程中控制轉(zhuǎn)錄水平。這些特殊序列稱為——又稱弱化子，位于一些操縱子中第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前，是一段能減弱轉(zhuǎn)錄作用于的順序。

47 組合式基因調(diào)控：每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的，而是幾種因子組合，發(fā)揮特定的作用，稱為——

48 細(xì)胞通訊：細(xì)胞間識(shí)別、聯(lián)絡(luò)和相互作用的過程稱為——

49 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：針對(duì)外源信號(hào)所發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)全過程稱為——

50 調(diào)控結(jié)合元件：細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子有許多都是蛋白質(zhì)，其分子中存在著一些特殊的結(jié)構(gòu)域，它們是信號(hào)分子相互識(shí)別的部位，信號(hào)分子通過這些特殊結(jié)構(gòu)域的識(shí)別和相互作用而有序銜接，形成不同的信號(hào)傳遞鏈或稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些結(jié)構(gòu)域稱為——

51 第二信使：G蛋白活化之后唧 可激活其下游的效應(yīng)分子，如腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C等。這些效應(yīng)分子隨后可催化一些分子的產(chǎn)生或濃度和分布的變化。這些小分子能夠繼續(xù)向下游傳遞信息，因而被稱為細(xì)胞內(nèi)小分子信使，亦稱為第二信使。已知的細(xì)胞內(nèi)小分子信使包括cAMP、cGMP、甘油二酯（DAG）、IP3和Ca2+等等。

52 DNA重組：不同來源的DNA分子可以通過末端共價(jià)連接（磷酸二酯鍵）而形成重新組合的DNA分子，這一過程稱為——

53 限制酶：是一類內(nèi)切核酸酶，因而又稱為限制性內(nèi)切核酸酶。這類酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二酯鍵。

54 同功異源酶：來源不同的酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱為——

55 同尾酶：有些限制酶識(shí)別序列不同，但是產(chǎn)生相同的粘性末端，這些酶為——

56 Klenow片段：用枯草桿菌蛋白酶可將DNA聚合酶I裂解為大小兩個(gè)片段，大片段的分子量為76kD，這個(gè)片段也稱為——

57 入 噬菌體：是感染細(xì)菌的病毒，其基因組是線性雙鏈DNA分子，當(dāng)其感染宿主細(xì)胞并將基因整合到細(xì)胞后，基因組DNA變成環(huán)狀，用于分子克隆中的載體。

58 基因文庫：采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA，將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為——

59 cDNA文庫：將cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都導(dǎo)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為—

60cDNＡ：是指體外用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，以mＲＮＡ為模板合成的互補(bǔ)ＤＮＡ。

６１轉(zhuǎn)化：是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞。并使其獲得新的表型 的過程。

62 轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

63 轉(zhuǎn)染：真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。

64顯微注射法：在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，將外源基因通過毛細(xì)玻璃管，在顯微鏡下直接注射到受精卵的細(xì)胞核內(nèi)，稱為——

65 基因定點(diǎn)誘變：是指將基因的某一個(gè)或某些位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除的過程。

66 雙脫氧鏈終止法；是以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。

６７核酸分子雜交：是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過程。

６８探針：雜交體系中已知的核酸序列稱作探針。

６９　ＤＮＡ變性：在物理或化學(xué)因素作用下，例如加熱、酸堿或紫外線照射，可以導(dǎo)致兩條ＤＮＡ鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵（如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等）則不受影響，稱為——

常見方法：熱變性、堿變性、化學(xué)試劑變性。

７０　ＤＮＡ復(fù)性：當(dāng)促使變性的因素解除后，兩條ＤＮＡ鏈又可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成ＤＮＡ雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱——

７１印跡：凝膠中的ＤＮＡ片段雖然在堿變性過程中已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉(zhuǎn)移后，各個(gè)ＤＮＡ片段在膜上的相對(duì)位置與在凝膠中的相對(duì)位置仍然一樣，因而稱為——

７２　Northern印跡雜交：將待測(cè)ＲＮＡ樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固－液相雜交，檢測(cè)ＲＮＡ（主要是mＲＮＡ）的方法。

７３　斑點(diǎn)印跡：將ＲＮＡ或ＤＮＡ變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究，稱——

７４　原位雜交；核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱——

７５　液相雜交：待測(cè)核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子。目前常用的液相雜交的ＲＮＡ酶保護(hù)分析法（ＲＰＡ）、核酸酶Ｓ１保護(hù)分析法。

７６停滯效應(yīng)：（平臺(tái)期）：隨著目的ＤＮＡ擴(kuò)增產(chǎn)物的逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)ＤＮＡ擴(kuò)增產(chǎn)物的增加減慢，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)——

７７　筑巢ＰＣＲ：先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴(kuò)增獲取目的基因。

７８多重ＰＣＲ：是在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份ＤＮＡ樣品中不同序列的ＰＣＲ過程。

７９連接酶鏈反應(yīng)（ＬＣＲ連接酶擴(kuò)增反應(yīng)ＬＡＲ）：是以ＤＮＡ連接酶將某一ＤＮＡ鏈的５磷酸與另一相鄰鏈的３羥基連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反應(yīng)。

８０　基因打靶：是指通過ＤＮＡ定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。若定向敲除某個(gè)基因，稱為基因敲除，若定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄?，稱為基因敲入。

８１基因敲除：通過ＤＮＡ同源重組，使得ＥＳ細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失，然后通過ＥＳ細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為——；其基本程序：（１）構(gòu)建打靶載體；（２）ＥＳ細(xì)胞的體外培養(yǎng)；（３）重組載體轉(zhuǎn)染ＥＳ細(xì)胞；（４）重組體轉(zhuǎn)染的ＥＳ細(xì)胞的鑒定；（５）ＥＳ細(xì)胞胚胎移植和嵌合體雜交育種。

８２　打靶載體：由部分殘留的待敲除基因的同源片段、位于其內(nèi)部的neo基因和位于其外側(cè)的ＨＳＶ－tk基因共同構(gòu)成的載體即為——

８３ＤＮＡ芯片技術(shù)：指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量ＤＮＡ探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可得出樣品的遺傳信息。ＤＮＡ芯片的類型：原位合成芯片和ＤＮＡ微集陣列。

８４自發(fā)突變：引起ＤＮＡ一級(jí)結(jié)構(gòu)改變的原因主要有兩類：一類是復(fù)制時(shí)堿基的偶然性錯(cuò)配，由此引起的突變稱為自發(fā)突變；另一類是體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的自由基由某些環(huán)境因素引起的ＤＮＡ一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，由此引起的突變稱為誘發(fā)突變。

85 錯(cuò)義突變：DNA分子中堿基對(duì)的取代，使得mRNA的某一密碼子發(fā)生變化，由它所編碼的氨基酸就變成另一種不同的氨基酸，使得多肽鏈中氨基酸的順序也相應(yīng)地發(fā)生改變，這種突變稱——

86同義突變：堿基取代，在蛋白質(zhì)水平上沒有引起變化，氨基酸沒有被取代，這是因?yàn)橥蛔兒蟮拿艽a子與原來的密碼子代表同一個(gè)氨基酸，這種突變稱為同義突變。

87移碼突變：在編碼序列中，單個(gè)堿基數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體密碼閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來的正常蛋白質(zhì)，即所謂——

88原癌基因：是一種正常細(xì)胞的正?；颍谡＜?xì)胞中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白，在細(xì)胞增殖和分化中起重要調(diào)控作用，它不具有致癌性，但當(dāng)其受到物理、化學(xué)或病毒等致癌因素的作用而失控或發(fā)生突變時(shí)，可過度表達(dá)或持續(xù)表達(dá)其產(chǎn)物，就變成了癌基因，可以使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

89病毒癌基因：病毒所攜帶著的致轉(zhuǎn)化基因。

90抑癌基因（抗癌基因）：存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類可抑制細(xì)胞生長并具有潛在抑癌作用的基因。其表達(dá)產(chǎn)物主要包括跨膜受體、胞質(zhì)調(diào)節(jié)因子或結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞周期因子、DNA損傷修復(fù)因子以及其它一些功能蛋白。

91細(xì)胞周期素/周期依賴性激酶：有些蛋白激酶的細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性激活依賴于一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、累積與分解的蛋白質(zhì)，后者被稱為細(xì)胞周期素，前者——

92啟動(dòng)因子：在癌變的啟動(dòng)階段使細(xì)胞發(fā)生癌前期改變的因素。

93 ；基因診斷：是以DNA和RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。

94 基因治療：通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉、抑制異常表達(dá)基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法。

95 基因置換：（基因矯正）：將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

96 基因添加（基因增補(bǔ)）通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。

97 基因干預(yù)：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。

問答題：

1 衰老與基因的結(jié)構(gòu)與功能的變化有關(guān)，涉及到：（1）生長停滯；（2）端?？s短現(xiàn)象；（3）DNA損傷的累積與修復(fù)能力減退；（4）基因調(diào)控能力減退。

2 超螺旋的生物學(xué)意義：（1）超螺旋的DNA比松馳型DNA更緊密，使DNA分子體積變得更小，對(duì)其在細(xì)胞的包裝過程更為有利；（2）超螺旋能影響雙螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子（如酶、蛋白質(zhì)）之間的相互作用。

3 原核與真核生物學(xué)mRNA的區(qū)別：

原核：（1）往往是多順反子的，即每分子mRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息（來自幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因）。（2）5端無帽子結(jié)構(gòu)，3端一般無多聚A尾巴。（3）一般沒有修飾堿基，即這類mRNA分子鏈完全不被修飾。

真核：（1）5端有帽子結(jié)構(gòu)（2）3端絕大多數(shù)均帶有多聚腺苷酸尾巴，其長度為20-200個(gè)腺苷酸。（3）分子中可能有修飾堿基，主要有甲基化，（4）分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。

4 tRNA的共同特征：

（?。﹩捂溞》肿樱?3-93個(gè)核苷酸。（2）含有很多稀有堿基或修飾堿基。（3）5端總是磷酸化，5末端核苷酸往往是pG。（4）3端是CPCPAOH序列。（5）分子中約半數(shù)的堿基通過鏈內(nèi)堿基配對(duì)互相結(jié)合，開成雙螺旋，從而構(gòu)成其二級(jí)結(jié)構(gòu)，開頭類似三葉草。（6）三級(jí)結(jié)構(gòu)是倒L型。

5 核酶分類：（1）異體催化的剪切型，如RNaseP；（2）自體催化的剪切型，如植物類病毒等；（3）內(nèi)含子的自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA前體。

6 hnRNA變成有活性的成熟的mRNA的加工過程：

（1）5端加帽；（2）3端加尾（3）內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接；（4）分子內(nèi)部的甲基化修飾作用，（5）核苷酸序列的編輯作用。

7 反義RNA及其功能：

堿基序列正好 與有意義mRNA互補(bǔ)的RNA稱為反意義或反義RNA，又稱調(diào)節(jié)RNA，這類RNA是單鏈RNA，可與mRNA配對(duì)結(jié)合形成雙鏈，最終抑制mRNA作為模板進(jìn)行翻譯。這是其主要調(diào)控功能，還可作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA互補(bǔ)結(jié)合抑制DNA的復(fù)制，以及在轉(zhuǎn)錄水平上與mRNA5末端互補(bǔ)，阻止RNA合成轉(zhuǎn)錄。

8 病毒基因組分型：（1）雙鏈DNA（2）單鏈正股DNA（3）雙鏈RNA（4）單鏈負(fù)股RNA（5）單鏈正股RNA

9 病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)：

（1）不同病毒基因組大小相差較大；（2）不同病毒的基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸。（3）病毒基因組有連續(xù)的也有不連續(xù)的；（4）病毒基因組的編碼序列大于90%；（5）單倍體基因組，（6）基因有連續(xù)的和間斷的，（7）相關(guān)基因叢集；（8）基因重疊（9）病毒基因組含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因，主要類型有：a幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)無間隔；bmRNA沒有5端的帽結(jié)構(gòu)；c結(jié)構(gòu)基因本身沒有翻譯起始序列。

10 原核生物基因組的結(jié)構(gòu)的功能特點(diǎn)：

（1）基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成。

（2）基因組中只有1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

（3）具有操縱子結(jié)構(gòu)。（4）編碼順序一般不會(huì)重疊。（5）基因是連續(xù)的，無內(nèi)含子，因此轉(zhuǎn)錄后不需要剪切。（6）編碼區(qū)在基因組中所占的比例（約占50%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組，但又遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于病毒基因組。（7）基因組中重復(fù)序列很少（8）具有編碼同工酶的基因。（9）細(xì)菌基因組中存在著可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。

（10）在DNA分子中具有多種功能的識(shí)別區(qū)域。

11 真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)：

（1）每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，除了配子為單倍體外，體細(xì)胞一般為雙倍體。（2）真核基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大。（3）都由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（4）含有大量重復(fù)順序。（5）基因組內(nèi)非編碼的順序占90%以上。（6）真核基因是斷裂基因，（7）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，它們可串聯(lián)在一起，亦可相距很遠(yuǎn)，但即使串聯(lián)在一起的成簇的基因也是分別轉(zhuǎn)錄的。（8）真核生物基因組中也存在一些可移動(dòng)的遺傳因素，這些DNA順序并無明顯生物學(xué)功能，似乎為自己的目的而組織，故有自私DNA之稱。

12 根據(jù)同源性程度，主要分五種類型：（1）核酸序列相同，實(shí)際上是多拷貝基因；（2）核酸序列高度同源，如人類生長激素基因家族；（3）編碼產(chǎn)物具有同源功能區(qū)；（4）編碼產(chǎn)物具有小段保守基序；（5）基因超家族。

13 DNA復(fù)制的基本過程：（1）DNA雙鏈解開；（2）RNA引物的合成；（3）DNA鏈的延長；（4）切除引物、填補(bǔ)缺口、連接相鄰DNA片段；（5）切除和修復(fù)錯(cuò)配堿基。

14 DＮＡ的損傷方式：（１）轉(zhuǎn)換：由一種嘧啶變成另一種嘧啶，或種嘌呤變成另一種嘌呤；（２）顛換：嘧呤與嘌呤互換。轉(zhuǎn)換和顛換只引起ＤＮＡ局部的改變，而ＤＮＡ其它部分的結(jié)構(gòu)不受影響，故稱為點(diǎn)突變。（３）丟失或插入一個(gè)或一段核苷酸，可能使下游ＤＮＡ的編碼發(fā)生改變，此稱為移碼突變（４）鏈內(nèi)或鏈間發(fā)生共價(jià)連結(jié)。

１５?。模危翐p傷的修復(fù)：（１）光修復(fù)（２）切除修復(fù)（３）重組修復(fù)（４）ＳＯＳ修復(fù)

１６　切除修復(fù)的機(jī)制：通過一種特殊的內(nèi)切核酸酶將ＤＮＡ分子中的損傷部分切除，同時(shí)以另一條完整的ＤＮＡ鏈為模板，由ＤＮＡ聚合酶Ｉ催化填補(bǔ)被切除部分的空隙，再由ＤＮＡ連接酶封口，使ＤＮＡ恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)。

１７　大腸桿菌的一種需糖基化酶的切除修復(fù)過程：（１）ＤＮＡ糖基化酶識(shí)別受損的或錯(cuò)誤的堿基，水解糖苷鍵，釋出游離堿基，在ＤＮＡ單鏈上形成無嘌呤或嘧啶的空位，稱為ＡＰ部位；（２）特異的ＡＰ內(nèi)切核酸酶在ＡＰ部位切開磷酸二酯鍵，再由外切核酸酶切下ＡＰ部位的核苷酸；（３）ＤＮＡ聚合酶Ｉ修補(bǔ)缺口；（４）ＤＮＡ連接酶封口，完成修復(fù)過程。

１８逆轉(zhuǎn)錄酶功能：（１）具有ＲＮＡ指導(dǎo)的ＤＮＡ聚合酶活性，能和其它ＤＮＡ聚合酶一樣沿５－３方向合成ＤＮＡ，并需要引物提供３－ＯＨ；（２）具有ＲＮＡ酶Ｈ活性，能特異性水解ＲＮＡ－ＤＮＡ雜交體上的ＲＮＡ；（３）具有ＤＮＡ指導(dǎo)的ＤＮＡ聚合酶活性，以逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈ＤＮＡ為模板合成互補(bǔ)ＤＮＡ鏈。

１９　遺傳密碼的特點(diǎn)：（１）起始密碼子和終止密碼子；（２）方向性：５－３；（３）連續(xù)性（４）簡并性；（５）通用性（６）擺動(dòng)性。

２０　常見的擺動(dòng)現(xiàn)象（１）反密碼子的第一位常出現(xiàn)稀有堿基次黃嘌呤，它可以與密碼子的第三位的Ａ、Ｃ或Ｕ配對(duì)；（２）反密碼子中的Ｕ可以與密碼子中的Ａ或Ｇ配對(duì)；（３）反密碼子中的Ｃ可以與密碼子中的C、G或U配對(duì)。

21 核糖體在蛋白質(zhì)生物合成中的作用：（1）容納mRNA的通道，（2）能夠結(jié)合起始因子，延長因子及終止因子等參與蛋白質(zhì)生物合成的因子；（3）具有結(jié)合氨酰-tRNA的部位（A位或P位）；（4）具有轉(zhuǎn)達(dá)肽酶活性，催化肽鍵形成；（5）大亞基上具有延長因子依賴的GTP酶活性，它可能為肽提供能量。

22 嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)機(jī)制：在氨基酸缺乏時(shí)，游離核糖體與空載的tRNA增加，在ATP存在下，產(chǎn)生pppGpp（鳥苷-5-磷酸）和ppGpp(鳥苷-4-磷酸)。后者與RNA聚合酶形成ppGpp-RNA聚合酶復(fù)合物，進(jìn)而使RNA聚合酶構(gòu)象改變，活性降低，rRNA和rRNA合成減少或停止。

22 葡萄糖效應(yīng)及機(jī)制：細(xì)菌通常優(yōu)先以葡萄糖作為能源，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中有葡萄糖時(shí)，即使加入乳糖、阿拉伯糖等其它糖，細(xì)菌也不利用這些糖，不產(chǎn)生代謝這些糖的酶，直到葡萄糖消耗完畢，代謝其它糖的酶才會(huì)根據(jù)相應(yīng)的糖是否存在而被誘導(dǎo)產(chǎn)生，這種現(xiàn)象稱為——這是由于葡萄糖代謝產(chǎn)物能抑制細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶和激活磷酸二酯酶的活性，結(jié)果使細(xì)胞人cAMP水平降低。當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，即可通過CAP調(diào)控其它操縱子的表達(dá)。

23真核生物基因表達(dá)在DNA水平的調(diào)控方式：（1）染色質(zhì)丟失（2）基因擴(kuò)增（3）基因重排（4）DNA甲基化（5）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

24 反式因子的主要特點(diǎn)：（1）一般具有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其它蛋白的結(jié)合域。這些功能區(qū)含有幾十到幾百個(gè)氨基酸殘基（2）能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件。（3）對(duì)基因表達(dá)有正性和負(fù)性調(diào)控作用，即渡海和阻遏基因的表達(dá)。

25反式作用因子的激活方式及作用方式：激活方式（1）表達(dá)式調(diào)節(jié)；（2）共價(jià)修飾；（3）配體結(jié)合（4）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用。作用方式（1）成環(huán)（2）扭曲（3）滑動(dòng)（4）Oozing。

26 mRNA的選擇剪接方式：（1）外顯子選擇（2）內(nèi)含子選擇（3）互斥外顯子（4）內(nèi)部剪接位點(diǎn)。

27 細(xì)胞通訊方式：（1）細(xì)胞間隙連接（2）膜表面分子接觸通訊（3）化學(xué)信號(hào)通訊。

28 受體發(fā)揮其識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)換作用時(shí)特點(diǎn) ：（1）高度特異性（2）高親和力（3）可飽合性（4）可逆性。

29MAPK作為細(xì)胞內(nèi)的的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如何發(fā)揮作用：

MAPK由其上游分子MAPKK和MAPKKK通過逐級(jí)磷酸化反應(yīng)而激活。細(xì)胞受到生長因子或其它因素刺激后，MAPKK可將AMPK的一個(gè)Thr磷酸化，從而使MAPK轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)。具體表現(xiàn)為各自的逐級(jí)磷酸化，MAPK被激活以后，可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。在核內(nèi)，它可使一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，從而改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的狀態(tài)。另外，它也可以使一些其它的酶發(fā)生磷酸化使之活性發(fā)生改變。

30 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的基本路線和方式可以表示為：

小分子信使?jié)舛然蚍植甲兓?/p>

外源信號(hào)—受體—大分子信使 化學(xué)修飾 效應(yīng)分子構(gòu)象變化—細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)

蛋白質(zhì)相互作用

31G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)傳遞的基本過程包括：

（1）配體與受體結(jié)合；（2）受體激活G蛋白（3）G蛋白激活或抑抑細(xì)胞中的效應(yīng)分子；（4）效應(yīng)分子改變細(xì)胞內(nèi)小分子信使的含量與分布；（5）細(xì)胞內(nèi)小分子信使作用于相應(yīng)的靶分子，使之構(gòu)象改變，從而改變細(xì)胞的代謝過程及基因表達(dá)等功能。

32 G蛋白的循環(huán)或活化過程：

當(dāng)物理或化學(xué)信號(hào)刺激受體時(shí)，受體活化，與G蛋白結(jié)合并使之發(fā)生構(gòu)象改變。A亞基與GDP的親和力下降，結(jié)合的GDP為GTP所取代。A亞基結(jié)合了GTP后即與BR亞基發(fā)生解離，成為活化狀態(tài)的A亞基。活化了的A亞基此時(shí)可以作用于下游的各種效應(yīng)分子。這種活化狀態(tài)將一直持續(xù)到GTP被A亞基自身具有的GTP酶水解為GDP。

33 小分子細(xì)胞內(nèi)信使一般具有的三個(gè)特點(diǎn)：

（1）不位于能量代謝途徑的中心；（2）在細(xì)胞中的濃度或分布可以迅速地改變；（3）作為變構(gòu)效應(yīng)劑作用于相應(yīng)的靶分子，已知的靶分子主要為各種蛋白激酶。

34 表皮生長因子受體（EGFR）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

EGFR——Ras——MAPK

（1）受體二聚體的形成及其磷酸化；（2）募集接頭蛋白Grb2：（3）調(diào)控分子SOS的活化（4）低分子量G蛋白R(shí)as的活化；（5）MAPK的級(jí)聯(lián)激活；（6）轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

35 r——干擾素受體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：

r-干擾素與受體結(jié)合以后。也可以導(dǎo)致受體二聚體化，二聚體化的 體可以激活JAL-STAT系統(tǒng)，后者將干擾素刺激信號(hào)傳入核內(nèi)。

JAK為一種存在于胞漿中的蛋白酪氨酸激酶，它活化后可使干擾素受體磷酸化。STAT可以通過其SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別磷酸化的受體并與之結(jié)合，然后STAT分子亦發(fā)生酪氨酸的磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT形成二聚體并進(jìn)入胞核。二聚體STAT分子作為有活性的轉(zhuǎn)錄因子，影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而改變靶細(xì)胞的增殖與分化。

36 Klenow片段的用途：（1）補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端；（2）通過補(bǔ)齊3端使3末端標(biāo)記；（3）在cDNA克隆中，第二股鏈的合成。（4）DNA序列分析。

37 幾種常見修飾酶：

（1）DNA聚合酶I：這個(gè)酶除有聚合酶活性外，尚有3-5及5-3核酸外切酶活性。由于它具有5-3核酸外切酶活性，當(dāng)用缺口平移法標(biāo)記DNA探針時(shí)，常用DNA聚合酶I。

（2）逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DAN，合成時(shí)需要4種脫氧核苷酸及引物，合成方向?yàn)?-3延伸，無3-5外切酶活性。廣泛用于mRNA為模板合成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫。

（3）T4DNA連接酶：催化雙鏈DNA一端3-OH與另一雙鏈DNA的5端磷酸根形成3、5-磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端連接起來。

（4）堿性磷酸酶：去除DNA或RNA 5 端的磷酸根，制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接，提高重組效率。

（5）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶：（TdT）：將脫氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。

（6）TaqDNA聚合酶和其它耐熱DNA聚合酶。

38 作為克隆載體的質(zhì)粒具備以下特點(diǎn)：

（1）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，（3）具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)（MCS）。

39 粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記（2）帶有入噬菌體的粘性末端（cos區(qū)）；（3）具有一個(gè)或多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)；（4）其本身分子量小，容納40kb左右的DNA片段；（5）由于非重組粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而體外包裝的主要是重組體，有利于以后的篩選。

40 M31噬菌體的優(yōu)點(diǎn)：（1）噬菌體顆粒中所含有的是單鏈DNA，該單鏈DNA可作為模板用于DNA序列分析；（2）利用單鏈M13克隆可制備成單鏈DNA探針用于雜交分析，檢測(cè)DNA或RNA，或者作為基因定點(diǎn)誘變的載體。

41大腸桿菌與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的不同：

大腸桿菌：含有復(fù)制位點(diǎn)、抗性基因、克隆位點(diǎn)，可導(dǎo)入大腸桿菌，與克隆載體一樣，表達(dá)載體中含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

哺乳動(dòng)物：真核表達(dá)載體中含有一套真核表達(dá)元件：；啟動(dòng)子/增強(qiáng)子-克隆位點(diǎn)-終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)。

42 重組DNA的目的和基本過程：

目的：（1）克隆某個(gè)特定的基因；（2）建立基因文庫、cDNA文庫，（3）將特定的基因片段進(jìn)行亞克隆以進(jìn)行DNA序列測(cè)定；（4）構(gòu)建表達(dá)載體以便在特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)某個(gè)基因。

過程：（1）制備目的基因和相關(guān)載體（2）將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接（3）將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（4）DNA重組體的篩選和鑒定（5）DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其它研究。

43 cＤＮＡ的合成過程：先從細(xì)胞中提取高質(zhì)量的mＲＮＡ。因mＲＮA有poly(A)尾巴，可用12~18寡聚d(T)片段作為引物，加入4種dNTP,AMV(或MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶催化第一股鏈的合成。然后用RNaseH去掉mRNA，剩下的單鏈DNA的3端往往有自發(fā)回折（原因不明）形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，正好可以作為合成第二條DNA鏈的引物；由T4DNA聚合酶催化第二股鏈的合成，即得到雙鏈cDNA的混合體，采用S1核酸酶處理，可得到平端的雙鏈cDNA。

44 目的基因的篩選與鑒定：

首先篩選出轉(zhuǎn)化菌；然后篩選出帶有重組體的克?。蛔詈笫菍?duì)DNA重組體進(jìn)行鑒定。方法：遺傳學(xué)方法（插入滅活法、a-互補(bǔ)）；免疫學(xué)方法；核酸雜交法；PCR技術(shù)；酶切鑒定。

45 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法：（1）磷酸鈣共沉淀法（2）電穿孔法（3）DEAE-葡萄糖法（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因?qū)耄?）顯微注射法

46 在大腸桿菌中表達(dá)外源基因，主要考慮以下基本要素：

（1）目的基因如果來自真核細(xì)胞必須是cDNA，因?yàn)榇竽c桿菌沒有剪切內(nèi)含子的功能。（2）從真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏結(jié)合細(xì)菌核糖體的SD序列，因此，cDNA的起始密碼子（ATG）上游部分（5端非編碼區(qū)）是無用的，必須除去。（3）所用表達(dá)載體必須是大腸桿菌表達(dá)載體。含有大腸桿菌RNA聚合酶所能識(shí)別的啟動(dòng)子和SD序列。

47 寡核苷酸介導(dǎo)的誘變技術(shù)步驟：

（1）將目的DNA片段插入M13噬菌體載體；（2）以重組噬菌體制備單鏈DNA；（3）設(shè)計(jì)并合成誘變寡核苷酸引物；（4）誘變寡核苷酸引物與靶單鏈DNA雜交；（5）利用Klenow片段在雜交的寡核苷酸上延伸；（6）用T4DNA連接酶將新合成的雜合雙鏈DNA連接成雙鏈閉環(huán)DNA分子；（7）轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌；（8）篩選含有誘變DNA片段的重組噬菌體；（9）以含有誘變DNA的重組噬菌體制備單鏈DNA；（10）測(cè)序證實(shí)M13噬菌體DNA帶有目標(biāo)誘變而無其它誘變。最后從重組M13噬菌體RF型DNA中回收誘變的DNA片段，克隆到其它適當(dāng)?shù)妮d體中，對(duì)誘變DNA片段進(jìn)行進(jìn)一步研究。

48 雙脫氧鏈終止法基本原理：和模板互補(bǔ)結(jié)合的引物在DNA聚合酶作用下發(fā)生互補(bǔ)鏈的延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系中的2，3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與底物脫氧核苷三磷酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于延伸互補(bǔ)鏈末端，造成延伸終止。由于產(chǎn)生一系列分別終止于A、G、C、T位置的不同大小的DNA片段，應(yīng)用高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳可分辨僅相差一個(gè)核苷酸的20-500堿基的DNA片段，結(jié)合放射自顯影技術(shù)，便能直接讀出模板DNA的待測(cè)序列。雙脫氧終止法測(cè)定DNA序列的片段通?？寺∮贛13或質(zhì)粒pUC載體，利用多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的通用引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。較長鏈的待測(cè)DNA片段可采用隨機(jī)法、嵌套缺失法和引物延伸法進(jìn)行序列測(cè)定。

Maxam-Gilbert法基本原理：采用化學(xué)試劑處理末端放射標(biāo)記的DNＡ單鏈片段，造成堿基特異性切割，由此產(chǎn)生一組具不同長度的ＤＮＡ鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按分子大小分離和放射自顯影，直接讀出待測(cè)ＤＮＡ的核苷酸順序。

激光測(cè)序技術(shù)：應(yīng)用熒光基團(tuán)標(biāo)記引物或４種ddＮＴＰ，采用雙脫氧鏈終止法原理進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，雙脫氧核苷酸終止產(chǎn)物經(jīng)熒光激發(fā)產(chǎn)生信號(hào)，通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出被測(cè)序列。

４９　溫度對(duì)ＤＮＡ復(fù)性（雜交）的影響：

溫度過高不利于核酸復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的復(fù)性溫度是較Ｔm值低２５℃。在０度時(shí)雜交進(jìn)行非常緩慢，隨著溫度的升高，雜交率也明顯增加，當(dāng)溫度比Ｔm值低２０－２５度時(shí)，ＤＮＡ－ＤＮＡ雜交達(dá)到最高雜交率。但在更高溫度情況下，雙鏈分子逐漸趨向解鏈，當(dāng)溫度達(dá)到Ｔm－５度時(shí)雜交率即非常低。（１）錯(cuò)配率第增加１％，Ｔm值應(yīng)相應(yīng)下降１０－１５度；（２）ＲＮＡ／ＤＮＡ雜交體的穩(wěn)定性較ＤＮＡ／ＤＮＡ的穩(wěn)定性高，Ｔm值應(yīng)相應(yīng)增加１０－１５度；（３）ＲＮＡ／ＲＮＡ雜交體的Ｔm值應(yīng)相應(yīng)增加２０－２５度，因此，采用ＲＮＡ探針時(shí)，加入適量的甲酰胺以降低Ｔm值是必需的；（４）寡核苷酸探針的堿基數(shù)很少，可以采用下式計(jì)算寡核苷酸探針Ｔm值：Ｔm=4*(G+C)+2*(A+T)；寡核苷酸探針雜交反應(yīng)一般在低于Ｔm值５度下進(jìn)行。

５０　常用的Ｓouthern轉(zhuǎn)膜方法：（１）毛細(xì)管虹吸印跡法：（２）電轉(zhuǎn)印法（３）真空轉(zhuǎn)移法

５１?。觨uthern\Northern印跡法區(qū)別：

（１） 靶核酸：Ｎ所檢測(cè)的靶核酸是ＲＮＡ，Ｓ是ＤＮＡ（２）ＲＮＡ電泳：ＲＮＡ樣品依其分子量大小在變性膠中進(jìn)行分離，凝膠中需加入變性劑，防止ＲＮＡ分子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，維持其單鏈線性狀態(tài)。（３）轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，不需要再進(jìn)行變性和中和，直接采用毛細(xì)管虹吸法將膠中的ＲＮＡ轉(zhuǎn)移到膜上，也可采用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移法。

５２　核酸原位雜交步驟：（１）組織或細(xì)胞的固定（２）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（３）探針的選擇和標(biāo)記（４）雜交（５）雜交結(jié)果檢測(cè)。

５３　ＲＮＡ酶保護(hù)分析法（ＲＰＡ）基本程序步驟：（１）制備待測(cè)ＲＮＡ（２）ＲＮＡ探針的標(biāo)記（３）雜交（４）除去單鏈ＲＮＡ（５）電泳分析

５４　探針及標(biāo)記物的種類：

探針（１）cＤＮＡ探針（２）基因組ＤＮＡ探針（３）寡核苷酸探針（４）ＲＮＡ探針。

標(biāo)記物：（１）核素標(biāo)記物（２）非核素標(biāo)記物：半抗原、配體、熒光素、化學(xué)發(fā)光探針。

５５核酸體外標(biāo)記法分為化學(xué)法和酶法：（１）化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上。（２）酶法（酶促標(biāo)記法）：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核酸苷酸（ＮＴＰ或dＮＴＰ）分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻入到探針分子中去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上。

５６　酶促標(biāo)記法：（１）缺口平移法；（２）隨機(jī)引物法（３）ＰＣＲ標(biāo)記法（４）末端標(biāo)記法

５７缺口平移法原理：利用適當(dāng)濃度的ＤＮaseＩ在ＤＮＡ雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個(gè)５末端和一個(gè)３末端，３末端即可作為引物，在大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３ＤＮＡ聚合酶活性的催化下，以互補(bǔ)的ＤＮＡ單鏈為模板，依次將dNTP連接到切口的３端羥基上，合成新的ＤＮＡ單鏈；同時(shí)ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３核酸外切酶活性在切口處將舊鏈人５末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原ＤＮＡ分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。

５８?。校茫一具^程：（１）變性：通過加熱至９５度左右，使ＤＮＡ雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈ＤＮＡ，作為反應(yīng)的模板。（２）退火：將溫度降至引物的Ｔm值左右或以下，引物與ＤＮＡ模板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雜交鏈。（３）延伸：當(dāng)反應(yīng)體系溫度升至７０度左右時(shí)，ＴaqDNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的５－３ＤＮＡ鏈延伸反應(yīng)，形成新生ＤＮＡ鏈。

５９?。校茫乙镌O(shè)計(jì)的基本要求：（１）引物長度一般為１５－３０個(gè)核苷酸。（２）引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。（３）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（４）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免３端的互補(bǔ)重疊。（５）引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過７０％，引物３末端連續(xù)８?jìng)€(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增（６）引物３端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板ＤＮＡ配對(duì)（７）引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的５端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響ＰＣＲ反應(yīng)的進(jìn)行。

６０ＰＣＲ技術(shù)的要類型：（１）筑巢ＰＣＲ（２）共享引物ＰＣＲ（３）多重ＰＣＲ（４）不對(duì)稱ＰＣＲ（５）錨定ＰＣＲ（６）反向ＰＣＲ（７）彩色ＰＣＲ（８）原位ＰＣＲ（９）定量ＰＣＲ（１０）差異顯示ＰＣＲ（１１）重組ＰＣＲ。

６１　ＰＣＲ反應(yīng)體系包括：核酸模板、引物、ＴaqＤＮＡ聚合酶、緩沖液、Ｍg2+、dＮＴＰs、反應(yīng)溫度與循環(huán)次數(shù)。

６２　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及基本原理：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物?；驹恚簩⒛康幕颍ɑ蚧蚪M片段）用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物園的輸卵管（或子宮）中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。導(dǎo)入基因的方法有顯微注射法、胚胎干細(xì)胞法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源ＤＮＡ的檢測(cè)：（１）染色體及基因水平的檢測(cè)：斑點(diǎn)雜交、Ｓouthern雜交和ＰＣＲ分析、原位雜交等；（２）轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：利用Northern雜交、RNase保護(hù)分析及ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因mRNA的存在及表達(dá)水平。（３）蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，采用Western印跡分析法。

６３　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用：（１）對(duì)基因組織或階段特異表達(dá)的研究（２）通過研究轉(zhuǎn)入外源基因后的新表型，可以發(fā)現(xiàn)基因的新功能；（３）導(dǎo)入外源基因后，由于基因的隨機(jī)插入，可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源基因的突變，對(duì)這些突變表型進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)新的基因（４）可用于只在胚胎期才表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究（５）建立研究外源基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型（６）對(duì)遺傳性疾病的研究（７）建立人類疾病的動(dòng)物模型，（８）動(dòng)物新品種的培育（９）基因產(chǎn)品的制備（１０）在免疫學(xué)中，可用于對(duì)免疫機(jī)制、免疫相關(guān)疾病的研究及建立免疫性疾病動(dòng)物模型等。

６４　轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)路線：（１）選擇及獲得外源目的基因，（２）受體細(xì)胞培養(yǎng)，（３）選用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（４）將轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)（５）篩選陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞（６）培植陽性轉(zhuǎn)化植株（７）轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。

６５轉(zhuǎn)基因植物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：（１）可成為新的疫苗來源，植物病毒也成為人類疫苗的可能來源（２）因?yàn)橹参锊《緦?duì)動(dòng)物不致病，因此可利用植物病毒表達(dá)抗原蛋白的片段，以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。（３）還可產(chǎn)生單抗，作為化療藥物的靶向載體。

６６基因打靶的必備條件：（１）胚胎干細(xì)胞：ＥＳ細(xì)胞的特點(diǎn)：能在體外培養(yǎng)，并保留發(fā)育的全能性。體外培養(yǎng)要維持細(xì)胞的分裂增殖與正常的核型，同時(shí)抑制細(xì)胞的分化。（２）打靶載體：a、neo陽性篩選標(biāo)志：b、ＨＳＶ－tk陰性篩選標(biāo)志：

６７　構(gòu)建打靶載體的基本過程：（１）獲得目的基因（待敲除基因）的同源片段，將此ＤＮＡ片段克隆到一般的質(zhì)粒載體中；（２）從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端；（３）將neo基因克隆到帶有目的基因同源順序的線性質(zhì)粒中，使之位于殘留目的基因同源順序的中間；（４）在目的基因同源順序的外側(cè)線性化重組質(zhì)粒載體，將ＨＳＶ－tk基因克隆到此線性載體中。

６８?。模危列酒夹g(shù)的應(yīng)用：（１）ＤＮＡ序列測(cè)定（２）基因表達(dá)分析（３）基因組研究（４）基因診斷（５）藥物研究與開發(fā)（藥物篩選、新藥發(fā)現(xiàn)、合理用藥、中草藥鑒定和真假藥辨別）

６９引起ＤＮＡ一級(jí)結(jié)構(gòu)變異的誘變劑的作用機(jī)制：（１）堿基類似物誘發(fā)突變（２）改變ＤＮＡ的化學(xué)結(jié)構(gòu)（３）結(jié)合到ＤＮＡ分子上誘發(fā)移碼突變（４）紫外線及其其它射線引起的ＤＮＡ分子變化。

７０　突變類型：點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換）、缺失（一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從ＤＮＡ大分子上消失）、插入（一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入ＤＮＡ大分子中間）、倒位（ＤＮＡ鏈內(nèi)重組，使其中一段方向反置）

７１　突變所引起的遺傳效應(yīng)包括：（１）遺傳密碼的改變：錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、移碼突變；（２）對(duì)mRNA剪接的影響（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失。

72病毒癌基因與細(xì)胞癌基因的不同之處：

（１） 病毒癌基因與細(xì)胞癌基因相比，通常丟失了兩端的某些序列。（2）病毒癌基因沒有內(nèi)含子，而細(xì)胞癌基因中通常含有內(nèi)含子或插入序列。（3）病毒癌基因與同源的細(xì)胞原癌基因在外顯子序列中也有微小的差別。（4）病毒癌基因常會(huì)出現(xiàn)堿基取代或堿基缺失等突變，而細(xì)胞癌基因則較少發(fā)現(xiàn)這一類突變。

73癌基因家族：src\ras\myc\sis\erb\myb.

74 RB抑癌基因機(jī)制：RB蛋白在靜止細(xì)胞中與E2F結(jié)合成復(fù)合物，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性；P105-RB通過抑制多種原癌基因如c-myc\c-fos的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。

75 P53抑制細(xì)胞生長機(jī)制：（1）P53蛋白可抑制cyclinA的表達(dá)，故P53基因的變異或缺失，可使cyclinA過量表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞在DNA復(fù)制不完全時(shí)即進(jìn)入M期而致癌，（2）P53能阻礙DNA聚合酶與DNA復(fù)制起始復(fù)合物的結(jié)合而抑制DNA復(fù)制的啟動(dòng)，進(jìn)而阻止DNA的復(fù)制。（3）P53的酸性氨基酸末端結(jié)構(gòu)區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，它能激活一些抑制細(xì)胞分裂的基因而間接抑制細(xì)胞增殖。（4）正常P53還能抑制c-myc\ras基因或腺病毒E1A對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用。

76 癌基因活化致癌的主要機(jī)制：

（1）原癌基因點(diǎn)突變（2）原癌基因獲得外源啟動(dòng)子而激活（3）原癌基因因甲基化程度降低而激活（4）原癌基因的拷貝數(shù)增加（5）基因易位或重排使原癌基因激活

77 腫瘤發(fā)生的多基因協(xié)同作用：該假說認(rèn)為細(xì)胞癌變是多步驟、多重打擊的復(fù)雜過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各階段，至少需要兩個(gè)或多個(gè)不 同的癌相關(guān)基因的異常激活或失活，才有可能引起細(xì)胞的癌變。

直腸結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程可分6個(gè)階段：上皮細(xì)胞過度增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和轉(zhuǎn)移癌。從正常上皮細(xì)胞到上皮細(xì)胞過度增生可能涉及FAP基因異常（突變或失活），從早期腺瘤到中期腺瘤涉及K-ras的異常（突變），從中期腺瘤到晚期腺瘤涉及DCC基因異常（如丟失），從晚期腺瘤到直腸結(jié)腸癌涉及P53基因異常（丟失），癌轉(zhuǎn)移還涉及到其它基因的激活與失活，如nm23基因表達(dá)異常、血管生長因子基因表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ras刺激下增高等。

78 基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)（1）核酸分子雜交（2）聚合酶鏈反就（PCR）（3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)（4）限制酶酶譜分析（5）DNA序列測(cè)定（6）DNA芯片技術(shù)

79 DNA指紋特點(diǎn)：（1）一個(gè)DNA指紋探針可同時(shí)檢測(cè)十幾個(gè)、甚至幾十個(gè)位點(diǎn)的變異，（2）具有高度特異性（3）具有穩(wěn)定的遺傳性（4）DNA指紋圖譜具有體細(xì)胞穩(wěn)定性。

80 基因診斷的方法包括：（1）基因突變檢測(cè)；（2）多態(tài)性分析（3）基因表達(dá)的檢測(cè)（4）外源DNA的檢測(cè)。

81 基因診斷策略：一、遺傳性疾?。海?）直接診斷策略，即直接檢測(cè)導(dǎo)致遺傳病發(fā)生的各種基因突變；（2）間接診斷策略，即尋找具有基因缺陷的染色體并判斷被檢者是否具有這條染色體。

二、感染性疾?。横槍?duì)病原體的基因序列，設(shè)計(jì)特異性探針進(jìn)行分子雜交或合成特異的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即能對(duì)該疾病作出明確的病原體診斷；三腫瘤：（1）檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的突變及表達(dá)異常（2）檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因（3）檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物基因。四、法醫(yī)：應(yīng)用DNA多態(tài)性分析、DNA指紋技術(shù)。

82 基因置換的條件：（1）對(duì)導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解；（2）外來基因能有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞（3）導(dǎo)入基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定駐留（4）導(dǎo)入基因能有適度水平的表達(dá)（5）基因?qū)氲姆椒八幂d體對(duì)宿主細(xì)胞安全無害。

83 選擇轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞時(shí)，一般考慮以下幾個(gè)因素（1）不管是直接體內(nèi)還是間接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，選擇目的基因表達(dá)的組織細(xì)胞，最好是組織特異性細(xì)胞，（2）細(xì)胞較易獲得，縣城生命周期較長。（3）離體細(xì)胞較易受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。（4）離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時(shí)間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)仍較易成活。

目前常用的靶細(xì)胞：造血細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。

84 反義RNA在基因治療中的意義和需解決的問題及前景：

通過反義RNA結(jié)合細(xì)胞中特異mRNA而調(diào)控其翻譯，可望按劑量來調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)或功能。問題是：（1）專一性轉(zhuǎn)移問題（2）反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題。（3）受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)。

前景：（1）安全性高（2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)（4）能直接作用于一些RNA病毒。