寫在前面

????????今天推薦的是由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2020年12月7日發(fā)表于The Journal of Immunology（2020IF：5.422，JCRQ2）的一篇文章，通訊作者是Dandan Lin教授，研究表明USP20通過解偶聯(lián)K48相關(guān)的MITA泛素化促進(jìn)細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。

研究背景

????????IRF3激活的介質(zhì)（[MITA]也稱為STING）是環(huán)狀二核苷酸的直接傳感器，并介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)DNA觸發(fā)的先天免疫信號。MITA的活性受到泛素化和去泛素化的廣泛調(diào)節(jié)。

摘要部分

????????在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)USP20在HSV-1感染后與K48連接的泛素鏈相互作用并從MITA中去除，從而穩(wěn)定MITA并促進(jìn)細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。USP20的缺失會加速HSV-1誘導(dǎo)的MITA降解并損害IRF3和IkBa的磷酸化以及隨后在HSV-1感染或細(xì)胞質(zhì)DNA作用后誘導(dǎo)I型干擾素和促炎細(xì)胞因子。與Usp20+/+小鼠相比，Usp20-/-小鼠產(chǎn)生的I型干擾素和促炎細(xì)胞因子減少，對致死性HSV-1感染的易感性增加，HSV-1復(fù)制加劇。此外，將MITA補(bǔ)充到Usp20-/-細(xì)胞中可以完全恢復(fù)HSV-1觸發(fā)的信號傳導(dǎo)并抑制HSV-1感染。這些發(fā)現(xiàn)表明USP20在維持MITA的穩(wěn)定性和促進(jìn)先天抗病毒信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

研究內(nèi)容

1.USP20缺陷會損害DNA病毒觸發(fā)的信號

????????作者之前證明USP20在HSV-1感染后可以去泛素化并穩(wěn)定MITA。作者繪制了USP20與MITA相互作用的域，發(fā)現(xiàn)UCH域（aa150-700）與MITA相關(guān)。為了進(jìn)一步研究USP20在體內(nèi)抗病毒信號傳導(dǎo)中的作用，作者構(gòu)建了USP20缺陷小鼠。Usp20-/-小鼠生長發(fā)育正常。作者接下來通過將GFP標(biāo)記的USP20和Cherry標(biāo)記的MITA轉(zhuǎn)染到Usp20-/-BMDC中來檢查USP20和MITA的細(xì)胞定位。結(jié)果表明，HSV-1感染后，部分USP20和MITA共定位于細(xì)胞質(zhì)中。HSV-1感染導(dǎo)致MITA的點狀形成，這是MITA激活的標(biāo)志。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)敲除USP20并不影響HSV-1感染后MITA的點狀形成。

????????作者接下來用Usp20+/+和Usp20-/-細(xì)胞探究了USP20是否在DNA病毒觸發(fā)的下游基因表達(dá)中起作用。qRT-PCR分析結(jié)果表明，在感染HSV-1或轉(zhuǎn)染各種DNA配體后，與野生型對應(yīng)物相比，Usp20-/-BMDCs和BMDMs中Ifnb、Ip10、Il6或Isg56的誘導(dǎo)顯著降低。免疫印跡分析表明，與野生型對應(yīng)物相比，HSV-1誘導(dǎo)的IRF3、IkBa、USP18和p65磷酸化在Usp20-/-BMDC或BMDM中顯著受損。此外，敲除BMDC和BMDM中的USP20也顯著影響了IFN-b和TNF的產(chǎn)生。另一方面，通過HSV-1UL30基因的表達(dá)、上清液中的HSV-1滴度或H129-G4的GFP百分比監(jiān)測，與野生型對應(yīng)物相比，HSV-1在Usp20-/-BMDC中HSV-1病毒的復(fù)制得到加強(qiáng)。

研究結(jié)論：USP20在各種原代小鼠細(xì)胞中正向調(diào)節(jié)DNA病毒觸發(fā)的信號。

?

2.USP20對于RNA病毒觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必須的

????????作者接下來檢查了USP20是否在RNA病毒觸發(fā)的信號傳導(dǎo)中起作用。qRT-PCR分析表明，與野生型細(xì)胞相比，仙臺病毒(SeV)或腦心肌炎病毒(EMCV)誘導(dǎo)的Ifnb、Ip10和Il6表達(dá)在USP20缺陷型BMDC和MLF中相當(dāng)。一致地，敲除USP20不會抑制SeV或EMCV誘導(dǎo)的IRF3或IkBa磷酸化。此外，細(xì)胞內(nèi)poly(I:C)誘導(dǎo)的Ifnb、Ip10和Il6表達(dá)不受USP20敲除的影響。這些數(shù)據(jù)共同表明USP20對于RNA病毒觸發(fā)的信號傳導(dǎo)不是必需的。接下來，作者探究USP20是否影響I型IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。野生型和Usp20-/-MLF用H129-G4或HSV-1感染后，在有無IFN-α的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后進(jìn)行熒光顯微鏡檢查、流式細(xì)胞術(shù)或qRT-PCR分析。結(jié)果表明，野生型和Usp20-/-細(xì)胞之間的GFP強(qiáng)度或百分比或HSV-1UL30基因的mRNA水平相當(dāng)。此外，敲除USP20對IFN-α誘導(dǎo)的STAT1磷酸化沒有影響。這些數(shù)據(jù)共同表明USP20不調(diào)節(jié)I型IFN信號傳導(dǎo)或I型IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。

研究結(jié)論：USP20對于RNA病毒觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必須的。

?

3.?USP20缺陷小鼠更容易感染HSV-1

????????作者接下來探究了USP20在體內(nèi)DNA病毒感染中的功能。Usp20+/+和Usp20-/-小鼠靜脈注射HSV-1并連續(xù)八天監(jiān)測。與基因誘導(dǎo)分析的結(jié)果一致，Usp20-/-小鼠比Usp20+/+小鼠更容易受到致死性HSV-1感染。此外，在HSV-1感染后12小時，與Usp20+/+小鼠相比，Usp20-/-小鼠血清中IFN-b、IL-6和CCL5的誘導(dǎo)顯著降低。另一方面，與Usp20+/+小鼠相比，在HSV-1感染后,來自Usp20-/-小鼠的肺和腦中Ifnb和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)嚴(yán)重受損，并且HSV-1的復(fù)制加劇。斑塊測定的結(jié)果進(jìn)一步證實，與野生型對照相比，USP20缺乏導(dǎo)致Usp20-/-小鼠在感染后肺和腦中的HSV-1滴度增加。

研究結(jié)論：USP20正向調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)，并且對于宿主體內(nèi)針對DNA病毒的防御至關(guān)重要。

?

4.USP20介導(dǎo)抗病毒信號依賴于其DUB活性? ? ?

????????作者之前已經(jīng)表明USP20的DUB活性是MITA去泛素化所必需的。為了證實USP20 DUB活性在調(diào)節(jié)HSV-1觸發(fā)的體內(nèi)信號傳導(dǎo)中的重要作用，作者將WT USP20或其酶失活突變體USP20（C560/563S）轉(zhuǎn)染到Usp20-/-細(xì)胞隨后感染HSV-1感染或轉(zhuǎn)染ISD。qRT-PCR和ELISA分析的結(jié)果表明，HSV-1或細(xì)胞溶質(zhì)DNA誘導(dǎo)的Ifnb和Ip10表達(dá)以及IFN-b和TNF的產(chǎn)生在用USP20回補(bǔ)的Usp20-/-MLF中得到顯著恢復(fù)，用USP20突變體回補(bǔ)則沒有效果。

此外，HSV-1誘導(dǎo)的IRF3或IkBa的磷酸化因USP20而不是USP20（CS）的回補(bǔ)在Usp20-/-?MLFs中增加。一致地，HSV-1的復(fù)制在用USP20回補(bǔ)的Usp20-/-MLF中得到加強(qiáng)，但在用USP20(CS)回補(bǔ)的對照組中沒有。

研究結(jié)論：USP20介導(dǎo)的DNA病毒觸發(fā)信號增強(qiáng)需要其去泛素化酶活性。

?

5.USP20解偶聯(lián)K48連接的泛素化并穩(wěn)定MITA? ? ?

????????作者之前已經(jīng)證明，在HSV-1感染后，USP20的敲低會導(dǎo)致THP-1細(xì)胞中K48相關(guān)的MITA泛素化增加。與這些觀察結(jié)果一致，與Usp20+/+MLF相比，HSV-1誘導(dǎo)的K48連接的MITA泛素化在Usp20-/-MLF中顯著增加。將USP20而不是USP20(CS)回補(bǔ)的Usp20-/-MLFs削弱了HSV-1誘導(dǎo)的K48連接的MITA泛素化，表明USP20在病毒感染后從MITA中去除了K48連接的多泛素鏈，這可能會控制MITA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

????????為支持這一觀點，在感染HSV-1后，敲除USP20促進(jìn)了MITA的降解。此外，HSV-1或細(xì)胞質(zhì)DNA誘導(dǎo)的MITA降解被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷，但在Usp20-/-MLF中不受自噬抑制劑3MA的阻斷。這些數(shù)據(jù)共同表明，USP20通過解偶聯(lián)K48連接的MITA泛素化，促進(jìn)MITA的穩(wěn)定。因為在USP20缺陷細(xì)胞中MITA的降解加速，作者假設(shè)將MITA補(bǔ)充到USP20敲除細(xì)胞中將恢復(fù)病毒觸發(fā)的下游基因表達(dá)。正如作者預(yù)期的那樣，將MITA重組到Usp20-/-MLFs中恢復(fù)了HSV-1感染后IRF3和IkBa的磷酸化以及Ifnb、Il6和Ip10的表達(dá)。如通過H129-G4的GFP信號或上清液中的HSV-1滴度所示，HSV-1的復(fù)制在用MITA重建的Usp20-/-MLF中受到抑制。

研究結(jié)論：MITA是USP20在調(diào)節(jié)細(xì)胞對DNA病毒感染的抗病毒反應(yīng)方面的主要目標(biāo)。

?

結(jié)論與討論

????????在這項研究中，作者生成了USP20缺陷小鼠，并探究了USP20在先天抗病毒信號傳導(dǎo)中的作用。作者發(fā)現(xiàn)USP20的敲除會損害DNA病毒觸發(fā)的IRF3和NF-kB激活以及下游基因的表達(dá)，并促進(jìn)K48相關(guān)的泛素化HSV-1感染后MITA的蛋白酶體降解。一致地，USP20缺陷導(dǎo)致細(xì)胞和體內(nèi)HSV-1復(fù)制增強(qiáng), USP20缺陷小鼠對致死性HSV-1感染的易感性增加。作者的研究結(jié)果提供了證據(jù),表明USP20通過靶向MITA進(jìn)行去泛素化,在細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://doi.org/10.4049/jimmunol.1801447