A Novel lncRNA Panel Related to Ferroptosis, Tumor Progression, and Microenvironment is a Robust Prognostic Indicator for Glioma Patients

摘要：

目的：建立與鐵死亡、腫瘤進(jìn)展和微環(huán)境相關(guān)的 lncRNA panel，用于膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評(píng)估。

方法：通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA) 篩選與腫瘤進(jìn)展和微環(huán)境相關(guān)的 LncRNA。WGCNA 中突出顯示的與鐵死亡相關(guān)的重疊 lncRNA，并納入中國神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因組圖譜（CGGA）被確定為中心 lncRNA。利用中樞 lncRNA 的表達(dá)譜，我們進(jìn)行了最小絕對(duì)收縮和選擇算子 (LASSO) 回歸，并建立了與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征，以區(qū)分具有不同生存結(jié)果的膠質(zhì)瘤患者。使用 Kaplan-Meier 生存分析和 ROC 曲線在 TCGA、CGGA_693 和 CGGA_325 隊(duì)列中驗(yàn)證了 lncRNA 特征。使用定量實(shí)時(shí) PCR (qRT-PCR) 對(duì) 15 個(gè)膠質(zhì)瘤樣本驗(yàn)證了與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 面板。進(jìn)行多變量 Cox 回歸，并繪制并驗(yàn)證了列線圖。使用 TIMER 和 CIBERSORT 算法探索與簽名相關(guān)的免疫浸潤。

結(jié)果：本研究確定了 30 個(gè)與鐵死亡、腫瘤進(jìn)展和微環(huán)境相關(guān)的中樞 lncRNA。使用 30 個(gè)中心 lncRNA，我們開發(fā)了一個(gè) lncRNA 特征，在兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列（HRs>1，p< 0.05)。lncRNA 簽名揭示了一組 14 個(gè) lncRNA，即 APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1 和 SNHG18。使用 qRT-PCR 在臨床標(biāo)本中驗(yàn)證了這些 lncRNA 表達(dá)。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同數(shù)據(jù)集中存在強(qiáng)大的簽名預(yù)測準(zhǔn)確性。通過單變量和多變量回歸，我們證明基于 lncRNA 特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是調(diào)整臨床因素后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。用這些預(yù)后因素構(gòu)建了一個(gè)列線圖，它已經(jīng)證明了不錯(cuò)的分類和準(zhǔn)確性。此外，觀察到基于特征的分類與多種臨床特征和分子亞型相關(guān)。更遠(yuǎn)，+?T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓樹突狀細(xì)胞，表明免疫浸潤增加。

結(jié)論：我們建立了一種新的鐵死亡相關(guān) lncRNA 特征，可以有效地對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后進(jìn)行分層，并具有足夠的預(yù)測性能。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA，預(yù)后特征，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，癌癥基因組圖譜，中國神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因組圖譜

結(jié)果

Hub Long非編碼RNA的鑒定和富集分析

本研究的流程圖呈現(xiàn)在圖1.?使用 WGCNA 包，我們執(zhí)行了層次聚類并檢測到一個(gè)異常值（圖 2A）。Scale-free R?2中的截止值為0.95?，軟閾值功率設(shè)置為5（圖 2B）。聚類樹狀圖識(shí)別了 14 個(gè)模塊（圖 2C），其中綠松石模塊與腫瘤分級(jí)以及腫瘤微環(huán)境顯著相關(guān)（Cor>0.5，圖 2D）。具體而言，突出顯示了腫瘤分級(jí)、ESTIMATE 綜合評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分等特征。turquoise 模塊中上述特征的 GS 與 MM 的散點(diǎn)圖表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，表明這些 lncRNA 在 turquoise 模塊中的功能意義。圖 2E-H）。因此，總共選擇了嵌入 turquoise 模塊中的 1223 個(gè)臨床相關(guān) lncRNA。

預(yù)后特征的開發(fā)和驗(yàn)證

在 turquoise 模塊中的 1223 個(gè) lncRNA 中，303 個(gè) lncRNA 與鐵死亡有關(guān)。將 303 個(gè)與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 與 CGGA 的基因列表相交后，我們檢索到了 30 個(gè)中心 lncRNA。圖 3A）。30 個(gè)中樞 lncRNA（列）和鐵死亡相關(guān)基因（行）的表達(dá)之間的相關(guān)性在圖 3B.?顯示 30 個(gè)中心 lncRNA 預(yù)后價(jià)值的森林圖在圖 3C.?使用 30 個(gè)中心 lncRNA，我們使用 TCGA 數(shù)據(jù)集通過 Lasso 回歸選擇了 14 個(gè)關(guān)鍵 lncRNA。圖 4A、B）。如圖所示圖 4C，14個(gè)lncRNA如下（模型系數(shù)絕對(duì)值增加）：APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1和SNHG18。除了LINC00205的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為負(fù)系數(shù)，表明其對(duì)預(yù)后有保護(hù)作用外，其他lncRNA被觀察為具有正系數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)因素（圖 4C）。隨后，我們?cè)谔崛∠禂?shù)后用 14 個(gè) lncRNA 的系數(shù)加權(quán)表達(dá)水平計(jì)算了個(gè)體化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。以 3.04 的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為臨界值，將 TCGA 膠質(zhì)瘤患者分為高分組和低分組。在生存分析中這兩組之間顯示出顯著差異（圖 4D, HR = 3.1, 95% CI = 2.7–3.6,?p?< 0.001)。TCGA-膠質(zhì)瘤患者特征的 ROC 曲線分析在 1 年、3 年和 5 年時(shí)的 AUC 分別為 0.853、0.856 和 0.825。圖 4E）。風(fēng)險(xiǎn)圖清楚區(qū)分了風(fēng)險(xiǎn)組之間的生存狀態(tài)，紅點(diǎn)表示停止病例，藍(lán)點(diǎn)表示存活病例（圖 4F）。同樣，我們計(jì)算了 CCGA_693 和 CGGA_325 膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并將其分為具有相同臨界值 (3.04) 的高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組。與低危組相比，高危組患者預(yù)后較差（圖 4G,J）。CGGA_693 中特征的 ROC 曲線分析在 1 年、3 年和 5 年的 AUC 分別為 0.719、0.783 和 0.782，表明特征在預(yù)測患者生存率方面具有中等高的敏感性和特異性。圖 4H）。在基于 CGGA_325 (圖 4K）。此外，我們揭示了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存狀態(tài)的分布模式，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的生存時(shí)間明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者。圖 4I、4L）。

評(píng)估預(yù)后特征的獨(dú)立性

我們接下來試圖確定基于 lncRNA 特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否是膠質(zhì)瘤患者 OS 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和幾個(gè)臨床病理學(xué)變量，如性別、年齡、等級(jí)、IDH 突變狀態(tài)、1p19q 共缺失狀態(tài)、MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、放療和化療被包括在單變量和多變量 Cox 回歸分析中。單因素 Cox 回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、分級(jí)、放療、IDH 突變狀態(tài)、1p19q 共缺失狀態(tài)和 MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤患者的 OS 顯著相關(guān)，而性別和化療未顯示任何相關(guān)性。圖 5A，左面板）。通過多變量分析，四個(gè)變量被進(jìn)一步確定為 OS 的獨(dú)立預(yù)后因素，包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 (HR = 2.257, 95% CI = 1.437–3.544,?p?< 0.001)、年齡 (HR = 1.040, 95% CI = 1.022–1.059,?p?< 0.001)、分級(jí) (HR = 2.130, 95% CI = 1.365–3.324,?p?< 0.001) 和放療 (HR = 0.507, 95% CI = 0.279–0.920,?p?= 0.026) (圖 5A，右面板）。此外，亞組生存分析顯示，該特征預(yù)測化療組的總生存期（圖 5B), 沒有化療 (圖 5C), 放療 (圖 5D)，并且沒有放射治療 (圖 5E）。

借助上述獨(dú)立的預(yù)后因素，我們建立了一個(gè)用于預(yù)測個(gè)體 OS 的列線圖。如中所述圖 5F，臨床醫(yī)生可以直觀地預(yù)測年齡、腫瘤分級(jí)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分已知的個(gè)體的生存結(jié)果。1 年、3 年和 5 年生存預(yù)測的分類準(zhǔn)確度分別為 0.941、0.964 和 0.897（圖 5G）。此外，還使用校準(zhǔn)圖評(píng)估了預(yù)測準(zhǔn)確性，這表明基于列線圖的預(yù)測與術(shù)后 1 年、3 年和 5 年的實(shí)際生存率高度一致。圖 5H）。

預(yù)后分類器的臨床相關(guān)性

如圖所示圖 6A，預(yù)后分類器與多種臨床特征顯著相關(guān)，包括年齡、分級(jí)、化療、放療和 MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、1p19q 共缺失狀態(tài)和 IDH 突變狀態(tài)（p?< 0.001）。值得注意的是，lncRNA 特征和等級(jí)之間的相關(guān)性非常顯著。此外，我們分析了高級(jí)別和低級(jí)別樣本之間的 14 個(gè) lncRNA 特征的表達(dá)，組間結(jié)果不同（p?< 0.001）（圖 6B）。

使用定量實(shí)時(shí) PCR 驗(yàn)證長非編碼 RNA 表達(dá)

在 14 個(gè) lncRNA 中，與 LGG 相比，PVT1 和 SNHG18 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中的高表達(dá)在之前的研究中得到了驗(yàn)證（Zheng 等人，2021 年）。同樣，與 LGG 相比，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中報(bào)告了 lncRNA MIR155HG (?He et al., 2021?)。因此，我們?cè)诖蓑?yàn)證了臨床標(biāo)本中的其他 11 個(gè) lncRNA。如圖所示圖 6C, 我們成功驗(yàn)證了 11 個(gè) lncRNA, 即 APCDD1L-AS1, H19, LINC00205, LINC00346, LINC00475, LINC00484, LINC00601, LINC00664, LINC00886, LUCAT1, NEAT1 (q < 0.0001)。除 LINC00205 外，所有其他 lncRNA 在 HGG 中均上調(diào)（圖 6C、D）。

高危人群的免疫浸潤

使用 TIMER 算法，我們確定了高危組中上調(diào)的四種免疫細(xì)胞，即 CD8?+?T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓系樹突狀細(xì)胞。圖 7）。使用 CIBERSORT 算法，識(shí)別出更廣泛的免疫細(xì)胞成分，例如 B 細(xì)胞記憶、T 細(xì)胞 CD4?+記憶（靜息和激活）、巨噬細(xì)胞（M0、M1 和 M2）和肥大細(xì)胞激活。這些結(jié)果表明，在由鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征定義的高風(fēng)險(xiǎn)組中，免疫浸潤增加。圖 7）。

討論

由于膠質(zhì)瘤固有的異質(zhì)性，目前 WHO 對(duì)膠質(zhì)瘤的分類不足以表征不同的生存結(jié)果。即使有完善的分子標(biāo)志物，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后分層和治療仍然是挑戰(zhàn)。鐵死亡與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)，其在膠質(zhì)瘤中的關(guān)鍵作用最近已被揭示（Liu et al., 2020）。在這種情況下，本研究旨在為膠質(zhì)瘤建立一種新的與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征。

我們的研究通過 WGCNA 確定了 30 個(gè)與腫瘤分級(jí)和微環(huán)境相關(guān)的鐵死亡相關(guān) lncRNA。利用 30 個(gè)中心 lncRNA，我們開發(fā)了用于預(yù)后預(yù)測的 lncRNA 特征。在兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中，與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征在臨床上與膠質(zhì)瘤患者生存機(jī)會(huì)的不同分層相關(guān)。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同數(shù)據(jù)集中存在強(qiáng)大的簽名預(yù)測準(zhǔn)確性。通過單變量和多變量回歸，我們證明基于 lncRNA 特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是調(diào)整臨床因素后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。觀察到包含年齡、腫瘤等級(jí)、放射治療和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的列線圖在分類和預(yù)測性能方面都是準(zhǔn)確的。更重要的是，觀察到基于特征的分層與廣泛的臨床特征相關(guān)，包括腫瘤分級(jí)、MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、1p19q 共缺失狀態(tài)和 IDH 突變狀態(tài)。此外，在特征定義的高風(fēng)險(xiǎn)組中觀察到免疫浸潤增加，這導(dǎo)致了不利的生存結(jié)果。

鐵死亡相關(guān)lncRNA特征共突出顯示14個(gè)lncRNA，即APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1和SNHG18。在 14 個(gè) lncRNA 中，其中 8 個(gè)之前曾被報(bào)道過。據(jù)報(bào)道，H19 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中上調(diào)，并促進(jìn)了彌漫性內(nèi)在腦橋膠質(zhì)瘤的增殖（Roig-Carles 等人，2021）。LINC00346 通過靶向膠質(zhì)瘤中的 ROCK1（ Chen 等人，2020 年）和 miR-128-3p/SZRD1 軸（Geng 等人，2020 年）促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和凋亡。在缺氧膠質(zhì)瘤中觀察到 LINC00475 的過表達(dá)，沉默 LINC00475 可抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。于等人，2020a）。通過調(diào)節(jié) miR-141-3p/YAP1 軸，LINC00475 促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的腫瘤進(jìn)展（Yu et al., 2020b）。LUCAT1 是膠質(zhì)瘤中的一種致癌分子，其敲低可通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤中的 miR-375 來抑制細(xì)胞活力和侵襲（Gao et al., 2018）。LncRNA miR155HG 有助于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤生長和進(jìn)展（Wu et al., 2019），在之前的生物信息學(xué)分析中也發(fā)現(xiàn)了它的預(yù)后價(jià)值（Zheng et al., 2021）。NEAT1 被證明是膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤進(jìn)展的促成因素（Chen 等人，2018 年；Zhou 等人，2018 年））。PVT1通過調(diào)控miR-128-3p/GREM1 Axis和BMP信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展(?Fu et al., 2018?)。SNHG18 的上調(diào)通過抑制 Semaphorin 5A 來促進(jìn)膠質(zhì)瘤對(duì)放射治療的抵抗（Zheng et al., 2016）。與 LGG 相比，PVT1 和 SNHG18 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中的高表達(dá)在之前的研究中得到了驗(yàn)證（Zheng 等人，2021 年）。值得注意的是，lncRNA APCDD1L-AS1、LINC00205、LINC00484、LINC00601、LINC00664 和 LINC00886 的作用在本研究中首次報(bào)道和驗(yàn)證。

鄭等人。（鄭等人，2021) 建立了與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的免疫景觀和放射治療反應(yīng)相關(guān)的預(yù)后鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征。然而，他們對(duì)三個(gè)隊(duì)列應(yīng)用了中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，每個(gè)隊(duì)列中的分類為半對(duì)半，從而導(dǎo)致潛在的假陽性結(jié)果。值得注意的是，沒有其他關(guān)于膠質(zhì)瘤中鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征的報(bào)道。相比之下，本研究報(bào)告了與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征，該特征在不同隊(duì)列中具有相同截止值的膠質(zhì)瘤患者的存活率表現(xiàn)出明顯的分離。此外，還使用 qPCR 在高級(jí)和低級(jí)樣本之間驗(yàn)證了鐵死亡相關(guān) lncRNA 特征的表達(dá)水平。它可以轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境，作為告知個(gè)體化預(yù)后的測試組。針對(duì)這些 lncRNA 的療法有望提高療效。然而，缺乏功能驗(yàn)證被認(rèn)為是本研究的主要限制。lncRNA 的功能意義需要通過經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)論

本研究建立了一個(gè)與鐵死亡相關(guān)的 lncRNA 特征，可以有效地對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后進(jìn)行分層，對(duì)所有臨床指標(biāo)具有優(yōu)越的預(yù)測性能。這些發(fā)現(xiàn)可能為開發(fā)用于膠質(zhì)瘤預(yù)后和治療的新型生物標(biāo)志物鋪平道路。