基因功能研究，尤其是在細(xì)胞系的基因功能研究，通常是從三板斧開始的——基因干擾、基因過表達(dá)、基因敲除。三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。

如果表型不明顯，文章不好發(fā)，基金不好寫，那么找個(gè)的關(guān)聯(lián)基因，來一套組合三板斧，往往就能解決問題。沒什么是三板斧解決不了的，一套不行，那就再來一套。

基因干擾，作為三板斧的開路先鋒，因?yàn)閮r(jià)格實(shí)惠、操作簡單，而備受青睞。從化學(xué)合成RNA，到病毒包裝shRNA，再到CRISPR-dCas9介導(dǎo)的CRISPRi，以及Cas13a介導(dǎo)的mRNA水平的敲除，各種基因干擾技術(shù)紛雜繁復(fù)，那么哪種技術(shù)更勝一籌，哪種技術(shù)更合文章審稿人和專家的口味？基因干擾應(yīng)該怎么做？

目前，基因干擾方面應(yīng)用最廣泛最成熟的還是短發(fā)卡RNA（shRNA）介導(dǎo)的RNAi技術(shù)。過去十幾年，RNAi一直是基因功能研究尤其是功能基因組學(xué)篩選的首選方法。但是CRISPR技術(shù)的橫空出世，憑借著更低的脫靶效率，更高的干擾水平，尤其是乘著今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的東風(fēng)，勢(shì)必會(huì)沖擊RNAi的王座，成為審稿人和專家眼中的新寵兒。

那么，CRISPRi與RNAi究竟有什么不同，在做方案設(shè)計(jì)或者基金申報(bào)撰寫時(shí)，CRISPRi好在哪里？

CRISPRi技術(shù)基于一個(gè)沒有核酸酶活性的dCas9蛋白，即通過將RuvC和NHN兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域分別導(dǎo)入氨基酸突變D10A和H840A，使得Cas9蛋白失去切割DNA活性，但仍保留結(jié)合DNA的能力（Dead Cas9）。

當(dāng)dCas9被引導(dǎo)到某個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS（transcription start site）時(shí)，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導(dǎo)致基因沉默。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率，dCas9融合了一個(gè)基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB（krüppel-associated box）結(jié)構(gòu)域，此外，dCas9也可以融合雙抑制結(jié)構(gòu)域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

因此通常，CRISPRi擁有比RNAi更高的干擾效率和更低的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，在基因干擾能力上顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)。

Yi Zheng et al.CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivationin the brain.Nature Nueroscience. 2018

作者：海星生物 公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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