????????前面的視頻我們也介紹了WGCNA，大家去搜索引擎去搜WGCNA肯定也會找到很多教程。其實(shí)我們最重要的一步是理解算法的原理(關(guān)于WGCNA的入門知識和概念請大家務(wù)必參考文獻(xiàn)[1])，跑完這個代碼，能夠?qū)Y(jié)果進(jìn)行一個正確的解讀。我在專欄里也提到WGCNA的一個應(yīng)用現(xiàn)狀和存在的問題。那么如何解WGCNA的結(jié)果？這一篇會進(jìn)行詳細(xì)介紹。在正式介紹之前，我首先要指出WGCNA構(gòu)建的是一個相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，在解讀的時候一定要注意，我們得到的是一個相關(guān)性的結(jié)果，它不能導(dǎo)出因果關(guān)系。所以大家務(wù)必記住這句話，相關(guān)不代表因果，這是很重要的。

????????那要如何應(yīng)用呢？可不可以用到一個疾病的機(jī)制研究？是可以的，但是我們單純以WGCNA的結(jié)果來進(jìn)行一個機(jī)制的解讀，那是夸大了計算機(jī)分析的結(jié)果，是不合理的。生物的問題終歸要回到生物實(shí)驗(yàn)去解答。WGCNA得到的是一個相關(guān)性的結(jié)果，它可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供重要線索。比如我們用WGCNA進(jìn)行一個疾病標(biāo)記物的挖掘，那是可以的，但是如果說你要研究疾病的機(jī)制，WGCNA其實(shí)只是第一步。大家可以去看它在Nature雜志文章中的應(yīng)用，WGCNA只是論文中數(shù)據(jù)分析或者生物信息學(xué)分析的一個工具，只是論文內(nèi)容的一小部分。如果說是疾病標(biāo)記物的挖掘，我們后續(xù)還需要在臨床樣本中進(jìn)行一個實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，畢竟生老病死是大事，生物的問題最終還是要在生物樣本里面驗(yàn)證。如果是研究疾病機(jī)制的話，我們根據(jù)WGCNA提供的線索，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證要做的是基因敲除，或者基因過表達(dá)/干擾等等，以觀察這個基因和表型間真實(shí)的關(guān)系。如果敲除了表型的確發(fā)生變化，那因果關(guān)系是可以確立的。但是具體是如何調(diào)控的？特別是我們體內(nèi)的基因很多，調(diào)控關(guān)系很復(fù)雜。后續(xù)可以用分子生物學(xué)手段去研究，比如說以轉(zhuǎn)錄因子或者說蛋白蛋白相互作用的方式，所以我們可以采用比如免疫共沉淀或者說酵母雙雜交或者轉(zhuǎn)錄因子分析的一些方法來進(jìn)行機(jī)制研究，這才算是一個完整的研究的思路，形成一個有利于病人的完整論文（倘若要把分子用于疾病診斷、治療和預(yù)后）。但是目前有一些論文直接從WGCNA推到疾病機(jī)制，這是夸大了數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，是嚴(yán)重的錯誤。研究機(jī)制需要更多不同技術(shù)手段獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持。邁爾舍恩伯格在《大數(shù)據(jù)時代》里說，“要相關(guān)，不要因果” ，在大數(shù)據(jù)時代，有相關(guān)就夠了。這句話在標(biāo)記物挖掘方面存在一定合理性。

????????所以我們下面介紹一下如何解讀WGCNA的結(jié)果。首先是不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不同，可能會有不同的一個分析方法，但是利用WGCNA進(jìn)行模塊鑒定的這個流程都是一致，本質(zhì)上它是一個數(shù)據(jù)降維的過程，成千上萬的基因轉(zhuǎn)變?yōu)閹资畟€模塊。不管你實(shí)驗(yàn)如何設(shè)計，這個流程它是不變的，只不過我們最后得到的模塊，如何跟現(xiàn)有的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行一個關(guān)聯(lián)，使用不同的方法。所以我這邊總結(jié)了一下，主要有三種常見的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方式。第一種是沒有實(shí)驗(yàn)分組的數(shù)據(jù)，比如說都是某種腫瘤的組學(xué)數(shù)據(jù)。第二種的話是有實(shí)驗(yàn)分組的，比如說實(shí)驗(yàn)組跟對照組，這是兩組的，或者說有三組，比如說對照組，實(shí)驗(yàn)組，然后治療組等。第三種情況是一個時間序列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，就比如說每隔三個小時進(jìn)行一個取樣，然后得到的這個轉(zhuǎn)錄組或者其他的組學(xué)數(shù)據(jù)。這三種實(shí)驗(yàn)，它的WGCNA結(jié)果和樣本數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)可能用不一樣的方法。第一步進(jìn)行共表達(dá)模塊鑒定這個是一模一樣程，也就是我們把所有的樣本，如果你沒有特殊需求的話，是把所有的樣本拿來構(gòu)建這個基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行一個共表達(dá)模塊的鑒定。那么第一種情，比如說腫瘤的病理分型，現(xiàn)在乳腺癌有很多不同的病理分型。這時候我們的模塊可以跟這些分型進(jìn)行一個關(guān)聯(lián)。因?yàn)樗且粋€分類數(shù)據(jù)啊，也就類別數(shù)據(jù)。所以一般我們比如說可以用模塊ME值進(jìn)行一個聚類的分析。然后我們看聚類樹啊，應(yīng)該不同的亞型，它應(yīng)該是聚類到不同的樹枝下面，所以通過這個聚類樹，其實(shí)我們大致可以看出，哪一些模塊在哪一個病理分型里面，它的表達(dá)量是高的或者低的。當(dāng)然，這個聚類是一個定性的，如果要定量，可以使用ANOVA進(jìn)行分析（注意多重檢驗(yàn)的P值需要進(jìn)行校正如顯著性閾值修改為0.05/n），看哪些模塊ME值在不同病理分型中存在差異。如果病理分型是有序的分類變量，就說這個疾病它的一個程度是越來越嚴(yán)重的，那時候那這時候你就可以把它轉(zhuǎn)換為數(shù)值，然后跟我們模塊基因表達(dá)ME進(jìn)行一個相關(guān)分析，看哪個模塊和腫瘤發(fā)展最相關(guān)。因?yàn)閮烧吡烤V不一樣，所以可以進(jìn)行Sperman秩相關(guān)分析，獲得相關(guān)系數(shù)R和對應(yīng)P值。此外，NCBI GEO或者TCGA中腫瘤的樣本一般都有生存時間數(shù)據(jù)，因此可以簡單應(yīng)用每個模塊ME的高低進(jìn)行樣本分組，然后2組進(jìn)行生存分析比較（log rank test），發(fā)現(xiàn)哪個模塊和病人生存時間相關(guān)。當(dāng)然，復(fù)雜一些的話，可以采用多個模塊的表達(dá)組合進(jìn)行分組，如模塊A高表達(dá)+模塊C低表達(dá)為1組，模塊A低表達(dá)+模塊C高表達(dá)為1組，再進(jìn)行生存分析。也可以和其他數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，比如現(xiàn)如今很火的cibersort免疫細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)。第二種情況就是分組的數(shù)據(jù)，這是比較常見的一個實(shí)驗(yàn)設(shè)計。不管什么樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，對于我們鑒定到的模塊，每一個樣本都有對應(yīng)的模塊基因表達(dá)ME。所以我們通過簡單的分析比如說t檢驗(yàn)或者非參檢驗(yàn)來看每個模塊在實(shí)驗(yàn)對照組中是否存在差異，也可以得到模塊表達(dá)是上調(diào)還是下調(diào)，你就用實(shí)驗(yàn)組-對照組的ME。我們經(jīng)?？吹降奈墨I(xiàn)里面，一般都是這種情況。所以直接就是把實(shí)驗(yàn)組標(biāo)成1，對照處標(biāo)成0。這時候ME再跟這個實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相關(guān)分析。特別是我們樣本量多的時候，這個要注意，相關(guān)系數(shù)有時候很低，比如說0.1或者0.2以下，但是P值很顯著，這個其實(shí)沒有任何意義，就說這個模塊P值是很顯著，但是因?yàn)樗嚓P(guān)系數(shù)太低了。如果我們把這個模塊跟某種性狀，比如說實(shí)驗(yàn)分組，用散點(diǎn)圖畫出來。我們再去看啊，就可以看到如果相關(guān)性是0.1還是0.2的話，這個圖沒有什么規(guī)律，雖然說他因?yàn)闃颖玖勘容^多，而導(dǎo)致較低的P值。第三種情況就是一個時間序列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計啊，比如說這個樣本，我們是每隔三個小時進(jìn)行一個采樣。時間序列的話，我們一般會關(guān)注兩個點(diǎn)。一個點(diǎn)就是隨著時間，這個模塊基因表達(dá)ME會發(fā)生什么變化？是一直上調(diào)，還是說他會像一個周期性的sin曲線，就是成一個節(jié)律的表達(dá)模式。如果這個基因表達(dá)可能會越來越高或者越來越低，可能具有趨勢性，所以隨時間發(fā)展一直上調(diào)（一定時間范圍內(nèi)）。但是有些情況他沒有這個趨勢存在，就比如說他是一個節(jié)律相關(guān)的一個模塊。所以這個模塊他在白天12小時的時候他表達(dá)高，它的ME值應(yīng)該也是最高，然后在晚上12點(diǎn)的ME值最低呀，所以它是成一個節(jié)律性波動，就是說在一定范圍內(nèi)隨時間呈周期波動。節(jié)律相關(guān)的一個模塊，比如說我們鑒定到這個模塊，在正常里面它是成節(jié)律性的變化，在疾病里面他這個節(jié)律變化消失了。那我們就可以發(fā)現(xiàn)，可能這個疾病它是跟節(jié)律的異常是相關(guān)的。所以主要是這三種常見的一個實(shí)驗(yàn)設(shè)計，它的WGCNA結(jié)果應(yīng)該如何與樣本的屬性數(shù)據(jù)進(jìn)行一個整合，應(yīng)該就是用這個思路。最后的話我們介紹一下視頻中的那個流程，它得到的結(jié)果有很多包括圖形和表格，它到底什么含義，要如何解讀？

主要參考文獻(xiàn)

[1] 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 https://cjb.ijournals.cn/cjbcn/article/abstract/gc17111791

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