能檢測目標蛋白的變化如濃度、 小的化學修飾，以及和其他蛋白相互作用的變化

弱去垢劑提取細胞內(nèi)水溶性蛋白而不破壞細胞內(nèi)的有膜結(jié)構(gòu)，強去垢劑獲取所有膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)

上清液 supernatant-protein lysate

沉淀pellet

裂解在低溫和各種酶抑制劑的環(huán)境中進行，以防不想要的修飾等

幾種protein lysate：

whole cell lysate， nuclear lysate，cytoplasmic lysate

IP- immunoprecipitated ——篩選與目標蛋白相互作用的蛋白質(zhì)：

抗體加入識別靶蛋白，再加連到beads上的二抗以從裂解液沉淀，蛋白質(zhì)抗體復合物

1.PAGE電泳

2.轉(zhuǎn)膜

用特異性抗體可視化觀察目標蛋白

PAGE分為

非變性/天然non-denaturing PAGE——可以評估蛋白是否有帶電荷的化學修飾和其他分子或者蛋白的結(jié)合以及蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

denaturing/SDS PAGE——僅僅靠質(zhì)量，SDS陰離子去垢劑使蛋白質(zhì)變性并且均勻地帶上負電荷。可以用來評估影響蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化如共價修飾或者表達量的改變。

電泳緩沖液遍布整個腔室，用于在凝膠內(nèi)運行樣品。樣品上樣緩沖液（多含溴酚藍）是我們在將樣品上樣到凝膠中之前與樣品混合的緩沖液。running buffer and sample loading buffer

電泳緩沖液是加入電泳槽的，tris、甘氨酸緩沖液。樣品緩沖液就是loading buffer，處理蛋白樣品的，分離膠緩沖液是配制分離膠的tris-hcl ph8.8。

transfer

轉(zhuǎn)膜后進行雜交印跡

1. 電洗脫法- electroelution

聚丙烯酰胺凝膠直接和硝化纖維膜，或者其他惰性的能結(jié)合蛋白質(zhì)的物質(zhì)相接觸，并將兩者浸沒在一個充滿緩沖液的容器中。

負電極位于最靠近凝膠的地方，正電極位于最靠近膜的地方。

通過抗體作為探針標記（membrane is probed with an antibody），膜能準確識別感興趣的蛋白質(zhì)、特定殘基或化學修飾

blocking

膜對于蛋白質(zhì)親和力很高（包括抗體），因此要先盡量減少非特異性抗體結(jié)合

通過含有blocking agent的溶液如奶粉結(jié)合空出的區(qū)域，防止抗體非特異性結(jié)合

洗膜

隨后置于含有blocking solution和一抗的溶液中 incubate，然后用 washing buffer在輕微晃動mild agitation下進行洗滌。washing buffer有著和 blocking solution中一樣的溫和洗滌劑以便去除非特異性結(jié)合的一抗

二抗結(jié)合（便宜）

和二抗一起 incubate，同樣要有 blocking solution 和洗滌

二抗和reporter enzyme或者熒光基團 fluorophore 結(jié)合以便可視化

提高了可視化檢測的靈敏度，因為多個二抗分子可以和同一個一抗結(jié)合

最常用的二抗和辣根過氧化物酶結(jié)合，可以催化產(chǎn)生光（副產(chǎn)物）的反應，光的產(chǎn)生量直接和二抗結(jié)合數(shù)量成正比

最常見的記錄光輸出的方法是使用X射線膠片，其放在添加了底物的膜頂部，增加曝光時間會產(chǎn)生更強的信號，但是也會增大 noise（ 指在發(fā)生、檢查、測量或記錄系統(tǒng)中與信號存在與否無關(guān)的一切干擾。）