一、膜蛋白簡(jiǎn)介

膜蛋白在細(xì)胞中扮演著重要的角色：例如被熟知的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸?shù)裙δ?，也是用藥的理想的靶點(diǎn)，雖動(dòng)物細(xì)胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類(lèi)繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。

根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類(lèi)型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。

(1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來(lái)，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。

(2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般只有用去垢劑(detergent)使其膜解后才可分離出來(lái)。

附注：使用分級(jí)抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整合膜蛋白。

二、膜蛋白的提取方法

談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時(shí)這些方法常常組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化。由于蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異，其溶解度也各不相同.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性，同時(shí)可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機(jī)溶劑提取.

但是與胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于膜蛋白是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，然后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來(lái)。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，CHAPS(一種離子去污劑），Emulgen和Lubrol等表面活性劑。

1）先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過(guò)梯度離心得到含有膜蛋白的粗組分。（例如：用液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑，然后差速離心、蔗糖密度梯度離心。收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白?）

2）用特殊的去污劑選擇性的分離。?從膜上提取蛋白有許多困難。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來(lái)，然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定。去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對(duì)所需要蛋白質(zhì)的提取效率來(lái)確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟。雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑。這常常會(huì)引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的，他將不是一個(gè)問(wèn)題。如果不是用于測(cè)序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.許多文獻(xiàn)和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來(lái)溶解膜蛋白的去垢劑.然而，他們并不是普遍適用的.在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如 triton X-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類(lèi)去垢劑.

將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來(lái).這種做法的好處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無(wú)需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白，無(wú)論在種類(lèi)上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無(wú)疑對(duì)于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的. 酸溶解法簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。一般的都是利用4℃時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于Triton?X-114水溶液，在溫度超過(guò)20℃時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。

3 )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)：CMP分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P-端），又具有陽(yáng)離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級(jí)分離的目的。

4) 順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的沉淀用標(biāo)準(zhǔn)液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。

5)離心蛋白提取法（centrifugal protein extraction）

原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶脹破裂后，超高速離心

評(píng)價(jià)：盡管分級(jí)(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點(diǎn).該方法相較MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上發(fā)表的分級(jí)抽提法減去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡(jiǎn)化,總而言之是一種不錯(cuò)的方法。

6)detergent- based：提取時(shí)先用裂解液裂解胞膜（選用不同的去污試劑是關(guān)鍵），梯度離心分離細(xì)胞器(ER)，然后分級(jí)抽提方法。例如，去掉細(xì)胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時(shí)不溶的部分。

總的感受：細(xì)胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。

注意事項(xiàng)：膜蛋白的含量比較少，需要收集大量的細(xì)胞，艾美捷推薦用試劑盒提取膜蛋白如：膜蛋白細(xì)胞組分提取試劑盒，很短的時(shí)內(nèi)得到高純度的蛋白并且具有天然活性的多層跨膜蛋白，且能夠有效的去除多糖、核酸等雜質(zhì)。