一、高效液相色譜法

有機(jī)酸是果、蔬的主要組成分之一。果、蔬中有機(jī)酸的種類和含量變化很大。這些變化決定于品種、成熟度、氣候條件及其它因素。常用氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法來(lái)測(cè)定有機(jī)酸。果蔬中蘋(píng)果酸和檸檬酸的一般含量范圍見(jiàn)表17-1。

方法原理??

樣品經(jīng)處理后，直接將樣品液注入反相化學(xué)鍵合相色譜體系，用5g·L-1（NH4）2HPO4為流動(dòng)相，有機(jī)酸在兩相中分配分離，按照其碳原子數(shù)由少到多的順序從色譜柱中洗脫下來(lái)。用紫外檢測(cè)器（214nm）或示差折光檢測(cè)器檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較定量。

?主要儀器： ?高效液相色譜儀配CL色譜柱及紫外檢測(cè)器、微量注射器。

?試劑

（1）酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸等所需測(cè)定的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品；

（2）Sep-PAKC18凈化柱。

（3）5g·L-|（NH4）2HPO4，用H3PO4調(diào)至pH=2.5，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，離心脫氣后使用。

（4）0.01mol·L”-NaOH溶液。

?操作步驟

（1）有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。分別取適量有機(jī)酸單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣，如酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸等于25mL容量瓶中，用0.01mol·L--NaOH溶液溶解后定容，參照表17-1的含量范圍配制標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。

（2）樣品溶液的制備。對(duì)于液體樣品需經(jīng)合適倍數(shù)稀釋，用Sep-PAKC18 凈化柱處理，收集餾出液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。對(duì)于固體或半固體樣品，要將其搗碎，均質(zhì)后，加入一定量的0.01mol·L-INaOH溶液提取。經(jīng)離心分離或過(guò)濾后收集提取液，用Sep-PAKC18凈化柱處理，收集餾出液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

（3）色譜條件。

固定相∶C18鍵合相。

流動(dòng)相∶5g·L-1（NH4）2HPO4，pH=2.5。

流速∶2mL·min-’。進(jìn)樣量10μL。

檢測(cè)器∶紫外檢測(cè)器，214nm，0.1AUFS。

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測(cè)定和計(jì)算

（1）將待測(cè)樣10μL注入色譜儀，根據(jù)其峰高或峰面積設(shè)定有關(guān)最佳參數(shù)如最小峰面積。

（2）注入有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10μL，進(jìn)行色譜分析。

（3）以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間定性。

（4）根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各響應(yīng)值（峰高或峰面積）作一響應(yīng)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）分別注入待測(cè)樣品10μL，進(jìn)行色譜分析。

（6）根據(jù)各待測(cè)樣品的響應(yīng)值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的含量。若高效液相色譜儀配有微處理機(jī)，則不必配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，只要選擇與待測(cè)分析樣品濃度相近的（+10%以內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜儀，仍以保留時(shí)間定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)值由計(jì)算機(jī)計(jì)算出校正因子，再由計(jì)算機(jī)用比例計(jì)算法作定量計(jì)算。

?二、氣相色譜法

?方法原理??

在硫酸的催化下，使有機(jī)酸成為丁酯的衍生物，用氣相色譜法分別定量。可定量的有機(jī)酸有∶甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、乳酸、異戊酸、異乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、反丙烯三羧酸以及檸檬酸等。

?主要儀器

（1）氣相色譜儀。裝有氫火焰離子檢測(cè)器、程序升溫裝置和自動(dòng)記錄器。

（2）杜。填充100g·kg-'Silicone DC560、DiasolidL（60～80 目）的?3mm×2m玻璃柱或不銹鋼柱。

（3）電熱板。功率50W。

（4）試樣前處理用柱。?10mm×70mm玻璃柱2根。

（5）具塞試管。?25mm×100mm。

（6）旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器。

（7）滑線變壓器。

（8）玻璃器皿。20mL容量瓶、滴定管、移液管、冷凝管。

試劑

（1）離子交換樹(shù)脂。使用Amberlite（一種人工合成的酚甲醛離子交換樹(shù)脂）CG120、Amberlite CG4B（或Amberlite IRA410）。

（2）將上述有機(jī)酸分別配成已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，分析時(shí)需要的酸的最小含量，因酸的種類不同而異甲酸、乙酸等低分子酸為1mg左右蘋(píng)果酸、檸檬酸等為幾毫克；酒石酸如少于10mg便不能獲得高精度的分析結(jié)果。

?操作步驟

（1）試樣準(zhǔn)備。

蔬菜把樣品切成3mm見(jiàn)方，稱取25.0g加溫水（80℃，部分蔬菜可用800mL·L喜乙醇代替（*）研磨，提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用0.1mol·L-1NaOH溶液滴定，求總酸量，同時(shí)使有機(jī)酸成為鈉鹽。中和后的溶液，在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至約15mL，濃縮液移入25mL容量瓶并定容。必要時(shí)可過(guò)濾除去不溶物。

吸取此提取液10mL（E2）用Amberlite CG120、Amberlite CG4B（*3），得到有機(jī)酸組分，將其酯化（注4），供氣相色譜分析用（圖17-2）。

水果從新鮮水果樣品中稱取20.0g，加3倍量的800mL·L-乙醇研磨（半5），以離心分離后，收集上清液，殘?jiān)俜磸?fù)提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用0.1mol·L-1NaOH溶液中和。中和后在80℃恒溫水槽中加熱10min后，定容至200mL，使用前保存于冰箱中。

取此提取液10～50mL（半6），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無(wú)醇后，依次通過(guò)Amberite CG120、CG4B及CG120 柱，得到有機(jī)酸組分，加入酚酞指示劑并滴定，求出總酸含量。然后保存于約40℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（注7）濃縮，干涸后進(jìn)行丁酯化處理。

（2）酯化。用上述方法制備的有機(jī)酸中，加丁醇2mL，無(wú)水硫酸鈉2g，濃硫酸0.2mL，連接冷凝管，在電熱板上平穩(wěn)沸騰（半8）約30min（加熱時(shí)要不斷攪拌），使有機(jī)酸成為丁酯。

（3）酯的提取。酯化終了，加水和己烷各5mL，充分混合，使酯轉(zhuǎn)溶于己烷中，每次用己烷5mL提取3次。用移液管移入20mL容量瓶中，容量瓶中事先已裝有5g·1-1十九烷（內(nèi)標(biāo)）的己烷溶液1mL，用己烷定容。再加無(wú)水硫酸鈉0.5g，去除混入的微量硫酸。取5μL進(jìn)行氣相色譜分析。

（4）分析。柱子在60℃下保持6min后，以每分鐘升溫5℃速度升至250℃。氮?dú)?、氫氣、空氣的流量分別為60、50、900mL/min，注入口及檢測(cè)器的溫度為260℃。Sensitivity為10MΩ，Range為0.01V。

（5）工作曲線的制備。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸用上述方法制成丁酯后，用氣相色譜儀分析，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

?注釋

注1.蔬菜中的有機(jī)酸，50%～90%以結(jié)合酸的形式存在，用800mL·L 乙醇提取比用溫水的提取率低。

注2.其中所含總有機(jī)酸換算成檸檬酸要在100mg以下。分析蔬菜時(shí)以10～20mL為宜。

注3.薯類的溫水提取試樣，用離子交換樹(shù)脂處理需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以用800mL·L-1乙醇提取試樣，餾去乙醇后，進(jìn)行離子交換樹(shù)脂處理。

注4.大部分蔬菜試樣有時(shí)混入一些丁醇不溶物或酯化反應(yīng)液呈淺褐色，對(duì)測(cè)定值無(wú)影響。

注5.對(duì)于含結(jié)合酸多的水果，用溫水提取的提取率高。但果膠等混入，粘度將增大，往往會(huì)使以后的處理費(fèi)事，故乙醇的濃度應(yīng)選擇適當(dāng)。

注6.其中所含的總有機(jī)酸換算成檸檬酸要在100mg以下，水果以相當(dāng)于新鮮物重1～10g的試樣為宜。

注7.濃縮使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器即可，如能進(jìn)行冷凍干燥則更好。

注8.使用油浴也可，使用電熱板從試管底部加熱方便。沸騰激烈時(shí)用滑線變壓器調(diào)節(jié)。

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