環(huán)狀RNA介紹及應(yīng)用概述

新冠疫情加速mRNA疫苗的發(fā)展，多款疫苗的加速獲批推動(dòng)了mRNA核酸藥物的創(chuàng)新之路。1976年，Sanger等人首次在植物病毒中鑒定出了一類單鏈共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA分子，2012年以來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近十年間大量具有功能的環(huán)狀RNA不斷涌現(xiàn)。共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以保護(hù)環(huán)狀RNA不受核酸外切酶的降解，環(huán)狀RNA與mRNA相比擁有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀RNA通過(guò)非帽依賴的方式翻譯蛋白質(zhì)，作為mRNA 2.0，為開(kāi)發(fā)相對(duì)于mRNA更加高效的疫苗提供了可能。

環(huán)狀RNA同樣擁有mRNA疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)序列的優(yōu)化即可開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)品，大大的降低了生產(chǎn)的成本。環(huán)狀RNA還具有比mRNA更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以耐受RNA酶的降解，大大降低了保存和運(yùn)輸?shù)某杀荆挥捎诃h(huán)狀RNA具有天然的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使其不需核苷酸修飾即可高翻譯蛋白，避免機(jī)體內(nèi)先天免疫的影響。

環(huán)狀RNA人工制備的方法

環(huán)狀RNA技術(shù)替代mRNA優(yōu)勢(shì)明顯，產(chǎn)業(yè)化前景光明，如何實(shí)現(xiàn)環(huán)狀RNA的人工制備是環(huán)狀RNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵。目前，有三類常用的環(huán)狀RNA人工制備方法，包括Ⅰ型內(nèi)含子（T4 bacteriophage或Anabaena）自剪切、Ⅱ型內(nèi)含子自剪切和T4 RNA連接酶方法。

1.Ⅰ型內(nèi)含子（T4 bacteriophage或Anabaena）自剪切:

此前，Ⅰ型內(nèi)含子自剪切的方式已被廣泛用于體外環(huán)化短的RNA序列，58至124 nt的環(huán)化效率高達(dá)80%以上，但是對(duì)于長(zhǎng)序列（1500nt以上）的環(huán)化效率無(wú)法達(dá)到量產(chǎn)要求[1]。Y Grace Chen和Wesselhoeft等人使用兩種內(nèi)含子自剪切的方式，利用內(nèi)含子自剪接人工制備環(huán)狀RNA，分別引入了74 nt 和186 nt的噬菌體和魚(yú)腥藻外顯子序列[2,3,4]。通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)自剪接內(nèi)含子，以及合理設(shè)計(jì)有助于剪接的普遍存在的輔助序列（同源臂，輔助外顯子片段E1+E2，如圖1a，b），在體外有效環(huán)化長(zhǎng)度1500nt以上的RNA。2022年初，魏文勝教授使用圖1方法人工制備環(huán)狀RNA疫苗，并驗(yàn)證了環(huán)狀RNA新冠疫苗在小鼠和恒河猴身上針對(duì)變種新冠病毒的保護(hù)作用[4]。另外通過(guò)序列優(yōu)化設(shè)計(jì)利用T4 bacteriophage在體外可以做到無(wú)外源序列殘留的環(huán)狀RNA制備（如圖2），但此種方法制備環(huán)狀RNA效率低，暫不能滿足工業(yè)化需求[5]。

圖1. ?I型內(nèi)含子自剪切系統(tǒng)框架設(shè)計(jì)

2.?Ⅱ型內(nèi)含子自剪切:

如圖3所示，利用來(lái)自酵母菌Ⅱ型內(nèi)含子的自催化剪接反應(yīng)可以在體外人工制備環(huán)狀RNA，利用Ⅱ型內(nèi)含子的六個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域中的（D1-D3）以及（D5-D6）序列倒轉(zhuǎn)，可以形成自剪接活性的核酶，可在體外制備環(huán)狀RNA，此種方法制備的環(huán)狀RNA沒(méi)有外來(lái)序列的殘留，但制備效率低，目前很難進(jìn)行工業(yè)化制備[6]。

如圖4所示，用破傷風(fēng)桿菌Ⅱ型內(nèi)含子的自催化剪接反應(yīng)也可以體外人工制備環(huán)狀RNA，天然的破傷風(fēng)桿菌Ⅱ型內(nèi)含子的自催化剪切會(huì)將PIE系統(tǒng)中多余序列引入到目標(biāo)分子中，通過(guò)序列設(shè)計(jì)破傷風(fēng)桿菌Ⅱ型內(nèi)含子剪切系統(tǒng)也可以和酵母菌Ⅱ型內(nèi)含子剪切系統(tǒng)一樣做到無(wú)外源序列殘留的環(huán)狀RNA制備，但無(wú)外源序列殘留的環(huán)狀RNA制備效率有待提高[7]。

3.序列重設(shè)計(jì)體外制備環(huán)狀RNA：

如圖5所示，傳統(tǒng)方法用T4 DNA或T4 RNA連接酶借助夾板序列可以實(shí)現(xiàn)體外環(huán)狀RNA制備，但制備效率低純化工藝難，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化制備。來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)的梁興國(guó)教授原創(chuàng)性基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬RNA結(jié)構(gòu)，尋找最適RNA環(huán)化的斷口，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)需額外夾板鏈或輔助鏈進(jìn)行RNA的環(huán)化，本方法可顯著抑制成環(huán)過(guò)程大分子副產(chǎn)物的產(chǎn)生,制備效率高達(dá)93%[8]。本方法可以讓原來(lái)難以或不能環(huán)化的RNA序列可以高效環(huán)化。環(huán)化接口序列重設(shè)計(jì)的制備理念不但適用T4連接酶制備，還兼容適合內(nèi)含子自剪切系統(tǒng)體外高效制備環(huán)狀RNA。

環(huán)狀RNA人工制備——工具酶

體外環(huán)狀RNA的制備工藝已趨于成熟，其中規(guī)?；a(chǎn)過(guò)程中主要涉及的工具酶有T7耐熱RNA聚合酶、T4 RNA連接酶1/2、ssRNA環(huán)化酶、circGFP、circLuc標(biāo)準(zhǔn)品等，酶的靈活使用極大的方便生產(chǎn)流程，加速環(huán)狀RNA的應(yīng)用轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)化。

同時(shí)，消除線性RNA殘余的干擾，是人工制備高純度環(huán)狀RNA的關(guān)鍵。環(huán)狀RNA耐受Rnase R消化，高效的Rnase R可以完全清除線性RNA，Rnase R不僅是連接酶法環(huán)狀RNA人工制備的關(guān)鍵原料，在內(nèi)含子剪切的環(huán)狀RNA人工制備方法中也是必不可少的。

T7耐熱RNA聚合酶

T7耐熱RNA聚合酶可在更高的溫度下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。它可在37~52℃條件下進(jìn)行高效的體外轉(zhuǎn)錄，最佳溫度為37℃，50℃反應(yīng)條件下仍然保留60%以上的活性，而野生型在此溫度下無(wú)活性。在20 μL標(biāo)準(zhǔn)體系中，以1 μg本試劑的Control template為模板可產(chǎn)生150~200 μg的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度可達(dá)5000 nt。

吉賽自主研發(fā)的T7高產(chǎn)耐熱型RNA合成試劑盒可在體外高效合成多種類型的RNA，如mRNA、lncRNA、shRNA等。

應(yīng)用：利用該試劑盒得到的RNA適用于多種下游應(yīng)用，如RNA結(jié)構(gòu)和功能研究、反義RNA及RNAi實(shí)驗(yàn)、微陣列分析、顯微注射、體外翻譯和RNA疫苗等。

T4 RNA連接酶1

T4 RNA Ligase 1，即T4 RNA連接酶1（T4 Rnl 1），是一種依賴ATP的可以催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸分子間或分子內(nèi)5'-P末端與3'-OH末端之間形成磷酸二酯鍵的酶。

應(yīng)用：可用于ssRNA的分子間連接；ssRNA與ssDNA的分子間連接；ssRNA 3′-OH末端用放射性同位素5’-[ 32P]pCp等的標(biāo)記；單鏈Oligo RNA及Oligo DNA的合成；tRNA的特別修飾；在蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸等。

T4 RNA連接酶2

T4 RNA Ligase 2，即T4 RNA連接酶2（T4 Rnl 2），是一種ATP依賴的雙鏈RNA連接酶(double-strand RNA ligase，dsRNA Ligase)，可以用于雙鏈RNA進(jìn)行分子內(nèi)的環(huán)化連接和分子間的線性連接。T4 RNA Ligase 2與T4 RNA Ligase 1（R0502）不同的是，對(duì)雙鏈RNA中的nick的連接活性要大大高于對(duì)單鏈RNA末端的連接活性。

T4 RNA Ligase 2也可用于雙鏈核酸（RNA雙鏈、RNA/DNA雜合鏈或DNA雙鏈）分子內(nèi)或分子間RNA鏈的3’羥基和DNA鏈的5’磷酸基的連接。T4 RNA Ligase 2連接時(shí)需要5’磷酸和3’羥基的存在，可以是RNA鏈或DNA鏈的5’磷酸基和RNA鏈的3’羥基之間發(fā)生連接反應(yīng)。

應(yīng)用：主要用于連接雙鏈RNA中缺刻的連接（即雙鏈RNA的粘端連接），也可用于雙鏈結(jié)構(gòu)中，RNA 3’羥基與DNA 5’磷酸基的缺刻連接。

ssRNA環(huán)化酶

ssRNA Cyclase是一種耐熱連接酶，可催化單鏈DNA（ssDNA）和單鏈RNA（ssRNA）底物的離子分子連接（即環(huán)化），這些底物同時(shí)具有5’-單磷酸和3’-羥基。大于15個(gè)堿基的線性ssDNAs和ssRNAs被ssRNA Cyclase環(huán)狀化。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有5’-磷酸基團(tuán)和3’-OH 基團(tuán)。對(duì)于大于15 nt 的單鏈底物，該酶都能高效的連接。

應(yīng)用：ssRNA Cyclase能生產(chǎn)用于滾環(huán)復(fù)制或滾環(huán)轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)和NGS的單鏈DNA模板以及生產(chǎn)大于15 nt環(huán)狀RNA。

環(huán)狀RNA標(biāo)準(zhǔn)品（circGFP和circLuc）

為滿足circRNA領(lǐng)域?qū)?biāo)準(zhǔn)品的迫切需求，吉賽生物利用自身技術(shù)優(yōu)勢(shì)，推出2款circRNA標(biāo)準(zhǔn)品CircGFP、CircLuc。

CircGFP能夠在真核細(xì)胞中高效進(jìn)行GFP蛋白翻譯。下圖為使用制備的CircGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的案例。

上：明場(chǎng)。下：熒光。

CircLuc能夠在真核細(xì)胞中高效進(jìn)行熒光素酶的翻譯。下圖為使用制備的CircLuc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的案例。

RNase?R

RNase R (Ribonuclease R)是一種來(lái)源于大腸桿菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可從3’-5’方向?qū)NA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化環(huán)形RNA、套索結(jié)構(gòu)或3’突出末端少于7個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。

應(yīng)用：RNase R常用于基因表達(dá)和可變剪切研究，可消化線性RNA以使環(huán)形RNA (circRNAs)或套索結(jié)構(gòu)RNA (lariat RNA)得到富集。

參考文獻(xiàn)

[1].Puttaraju, M., and Been, M.D. (1992). Group I permuted intron-exon (PIE)

sequences self-splice to produce circular exons. Nucleic Acids Res. 20, 5357–5364

[2].Chen, Y.G., Kim, M.V., Chen, X., Batista, P.J., Aoyama, S., Wilusz, J.E., Iwasaki, A., and Chang, H.Y. (2017). Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228–238.e5.

[3].Wesselhoeft, R.A., Kowalski, P.S., Parker-Hale, F.C., Huang, Y., Bisaria, N., and Anderson, D.G. (2019). RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo. Mol. Cell 74, 508–520.e4

[4].Qu, L., Yi, Z., Shen, Y., Lin, L., Chen, F., Xu, Y., Wu, Z., Tang, H., Zhang, X., Tian, F., Wang, C., Xiao, X., Dong, X., Guo, L., Lu, S., Yang, C., Tang, C., Yang, Y., Yu, W., Wang, J., Zhou, Y., Huang, Q., Yisimayi, A., Liu, S., Huang, W., Cao, Y., Wang, Y., Zhou, Z., Peng, X., Wang, J., Xie, X.S., Wei, W., Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants, Cell (2022), doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.044.

[5].Rausch, J. W., Heinz, W. F., Payea, M. J., Sherpa, C., Gorospe, M., and Le Grice, S. F.

J. (2021). Characterizing and Circumventing Sequence Restrictions for Synthesis of Circular RNA In Vitro. Nucleic Acids Res. 49, E35. doi:10.1093/nar/gkaa1256

[6].CJarrell, K. A. (1993). Inverse Splicing of a Group II Intron. Proc. Natl. Acad. Sci. 90,

8624–8627. doi:10.1073/pnas.90.18.8624

[7].Chuyun Chen, Huanhuan Wei, Kai Zhang, Zeyang Li, Tong Wei, Chenxiang Tang, Yun Yang, Zefeng Wang. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.05.31.494115

[8].Chen, H., Cheng, K., Liu, X., An, R., Komiyama, M., and Liang, X. (2020a). Preferential Production of RNA Rings by T4 RNA Ligase 2 without Any Splint through Rational Design of Precursor Strand. Nucleic Acids Res. 48, e54. doi:10.1093/nar/gkaa181