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說到“免疫浸潤”，生物本科生、甚至高中生也能按字面意思來大致理解；
????說到“非編碼RNA”，從字面意思也能大致推斷一下；

? ? 但是，一旦提到“m6A”，很多人都沒接觸過，不知道是啥東東。

? ? 對于不了解的東西，天然產(chǎn)生距離感甚至抵觸感，這是人之常情

? ? 不過，對于科研來說，越是了解的人少，越是空白的地方，才越值得去跟蹤探索，是不是? ? ? ? 呀，?也不能事事都像下面這句話一樣呀，哈哈。

? ? 實際上，m6A作為一種基因調(diào)控方式，在做基礎研究方面，其復雜性剛好為課題研究提供了很強的故事性和探索性。然而，很多臨床醫(yī)生卻對這種復雜分子機制望而卻步。怎么能兼顧利用m6A的高創(chuàng)新性，又可以避免繁冗且高風險、高投入的實驗了，當首推生信數(shù)據(jù)挖掘了。（還在找生信方向的小伙伴看過來，m6A就像六邊形戰(zhàn)士，熱門又百搭，拿下高分不在話下）

? ? 利用m6A去做生信挖掘，是一條成功率非常高的思路，腫瘤或者非腫瘤的都有，比如如下幾篇：

? ? 剛好免疫浸潤和非編碼RNA也是研究熱點，那么，小云今天帶給大家一篇8+的將免疫浸潤、非編碼RNA和m6A進行整合的分析思路，供大家復現(xiàn)參考。

研究背景

一些腫瘤研究報道指出，與m6A修飾和免疫相關的lncRNA在腫瘤發(fā)生和先天免疫中起著關鍵作用。但是當前尚無在膀胱癌中的報道，因此，本篇研究在膀胱癌中探索利用m6A修飾和免疫相關的lncRNA構建診斷模型。

數(shù)據(jù)來源

??數(shù)據(jù)集? ? ? ? ? ? ? ? ??數(shù)據(jù)庫? ? ? 數(shù)據(jù)類型? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?樣本信息

TCGA-BCA? ? ? ? ? ??TCGA? ? ? ? RNA-seq+臨床信息? ?1804名BCA患者

GSE154261? ? ? ? ? ?GEO? ? ? ? ?RNA-seq+臨床信息? ? 99名BCA患者

21個m6A調(diào)節(jié)基因? ?無? ? ? ? ? ? 無? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻報道

分析思路

? ? 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取膀胱癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應的臨床數(shù)據(jù)，使用單變量Cox回歸（univariate Cox regression?analysis）和皮爾遜相關分析（Pearson correlation analysis）確定與m6A修飾和免疫調(diào)節(jié)相關的lncRNA；再使用LASSO回歸分析建立風險模型，并進行了列線圖、ROC分析和Kaplan-Meier生存分析。根據(jù)風險模型，將患者分為低風險組和高風險組，對兩組患者之間進行了免疫細胞浸潤評分、臨床特征和對Talazoparib敏感性的比較分析（見下圖）。

主要結果

? ? 1.?與m6A修飾和免疫調(diào)節(jié)相關lncRNA的識別

從814條BCA相關的lncRNAs起始，通過與21個m6A調(diào)節(jié)基因的相關性分析，獲得了618條m6A相關的lncRNAs（圖1B）；通過與CIBERSORT免疫分數(shù)的相關性分析，獲得490條免疫相關的lncRNAs（圖1C）；根據(jù)總體生存和無進展生存信息，使用單變量Cox回歸分析，獲得49個lncRNA與預后相關，與上述兩種lncRNA取交集，共獲得47條與m6A相關、與免疫浸潤相關，且具有預后價值的lncRNAs（圖1D）。

亮點說明：

1，多數(shù)的診斷都是考慮單個因素，比如與m6a相關或者與免疫浸潤相關。這篇研究是將兩者進行結合，篩選出和兩個因素都相關的靶標基因，功能和意義更高；2，停留在mRNA層面的研究較多，做非編碼RNA的相對較少，則是第二個兩點了。

? ? 2. m6A-免疫-lncRNA風險評分的構建及其與臨床病理特征的相關性

對m6A-免疫-lncRNA進行LASSO Cox回歸分析，構建預測總生存率的風險評分。使用11種選定的lncRNA構建的風險模型（圖2A），包括每個lncRNA的系數(shù)（圖2B）和無進展生存率、總體生存率和疾病特異性生存率的森林圖（圖2C）。進一步對風險評分與臨床病理特征之間進行了相關性分析（圖2D）。高的風險評分的患者通常為膀胱癌晚期，且大多數(shù)高危組為基底鱗狀細胞亞型，而大多數(shù)低風險組腫瘤為腔乳頭狀細胞亞型。由此看來，以m6A-免疫-lncRNA對患者的分組和臨床特征之間存在顯著相關，具有一定的應用價值。

圖2?m6A-免疫-lncRNA風險評分的構建及其與臨床病理特征的相關性

? ? 3. 列線圖構建和GEO數(shù)據(jù)集的驗證

將風險評估模型與其他關鍵臨床特征相結合，包括診斷年齡和病理腫瘤分期分析，來預測患者OS、PFS和DSS。圖3A-C比較了高風險組和低風險組的無進展生存率、總體生存率和疾病特異性生存率。這三個列線圖在1年時的所有AUC均大于0.74，表明該模型具有重要的預后價值。為了驗證該模型的預測準確性，采用了獨立的數(shù)據(jù)集，GEO（GSE154261）進行驗證（圖3D）。ROC分析表明，該模型的AUC與TCGA數(shù)據(jù)集的AUC接近，表明該模型是穩(wěn)健的在其他數(shù)據(jù)集中具有較好的預測價值。

? ? 4. 高風險患者組和低風險患者組之間的差異比較

利用11個m6A-免疫-lncRNA所構建的風險預測模型，將患者分為高風險組和低風險組。分析發(fā)現(xiàn)，兩組患者之間存在很多重要基因的突變差異（圖4A）；同時，使用腫瘤免疫估計資源（TIMER）算法進行分析表明，低風險組可能具有更強的免疫原性，并且可能對免疫療法更敏感（圖4C）。所有的浸潤性免疫細胞包括CD4+和CD8+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B細胞和巨噬細胞都在高風險組更豐富。

圖4高風險患者組和低風險患者組之間的差異比較

? ? 5. 藥物敏感性預測和體外驗證

????對BCA細胞系進行風險模型分析，T24細胞風險得分最高，而RT112得分最低（圖5A）。利用GDSC數(shù)據(jù)庫進行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)BCA細胞對Talazoparib敏感性可能較高。通過克隆形成、細胞侵襲等實驗（圖5B-I），我們獲得的實驗數(shù)據(jù)和這個預測結果相一致。這個結果可能對BCA的臨床治療起到指導作用。

圖5藥物敏感性預測和體外驗證

文章小結

看完這篇文章是不是發(fā)現(xiàn)并沒有什么高難度分析手段，簡簡單單常規(guī)分析也可以發(fā)文。本文主要是將多個熱點進行了串聯(lián)，免疫浸潤、非編碼RNA、m6A，每一個單獨拎出來都可以打下一片天，現(xiàn)在合并在一起，正所謂“桃園三結義”，三人本就是人中龍鳳，合到一起那自然就能干出一番事業(yè)了。要想再發(fā)8+的生信分析文章，那自然是水到渠成的事了。

另外，本文只是以分享膀胱癌為引子，實際上不同腫瘤均可以進行類似分析，廣闊天地大有作為??！有想法的朋友盡快上車，一個方向一旦火爆起來，發(fā)文競爭力可就大多了，時不我待呀！

小云有話說

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