基因編輯服務(wù)

CRISPR/Cas9核酸酶可以形成特定序列的雙鏈DNA斷裂（DSB）。當(dāng)細(xì)胞使用非同源末端連接（NHEJ）途徑修復(fù)這些基因時(shí)，會(huì)產(chǎn)生小的插入或刪除突變（indels）并擾亂基因?；蛘撸珼SB可以通過(guò)同源重組修復(fù)途徑（HDR）特異性改變堿基，或者可以使用donor vector來(lái)形成基因插入。由于CRISPR/Cas9易于構(gòu)建和在人細(xì)胞中的毒性較低，在基因編輯中備受青睞。然而，由于iPSC不像普通腫瘤細(xì)胞系那樣具有總?cè)旧w異常和異常強(qiáng)烈的DNA損傷反應(yīng)的特點(diǎn)，基因編輯在人類(lèi)iPSC中成功率更低。CRISPR-U?采用了最大化基因組編輯效率的策略，我們?cè)谌祟?lèi)iPSCs中獲得的基因切割效率和同源重組效率比傳統(tǒng)方法提高10倍。

基因敲除

CRISPR-U?基因敲除iPSC細(xì)胞通過(guò)核轉(zhuǎn)染法將gRNA和Cas9轉(zhuǎn)入iPSC細(xì)胞中，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證，篩選出基因敲除的陽(yáng)性克隆。

應(yīng)用案例

人T-iPSC分化的CD8αβ細(xì)胞在CD4/CD8雙陽(yáng)性分化過(guò)程中，通過(guò)T細(xì)胞受體（TCR）α鏈的重排而失去抗原特異性。使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重組酶基因（RAG2）阻止了這種額外的TCR重排。含有穩(wěn)定的TCR的CD8αβ-T細(xì)胞在異種移植腫瘤模型能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些方法有助于安全有效的T細(xì)胞免疫治療。

參考文獻(xiàn)：

Minagawa, Atsutaka, et al. "Enhancing T cellreceptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy." Cell Stem Cell 23.6 (2018): 850-858.

基因點(diǎn)突變

CRISPR-U?基因點(diǎn)突變iPSC細(xì)胞

通過(guò)核轉(zhuǎn)染法將gRNA載體（含Cas9）和Donor共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，gRNA和Cas9復(fù)合物造成靶位點(diǎn)DNA雙鏈斷裂后，iPSC細(xì)胞以外源攜帶目標(biāo)點(diǎn)突變的Donor作為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），將目標(biāo)點(diǎn)突變重組到基因組靶位點(diǎn)。

gRNA載體攜帶抗性，可進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測(cè)序，篩選出點(diǎn)突變純合的陽(yáng)性克隆。

?· 細(xì)胞疾病模型建模

通過(guò)HDR，攜帶點(diǎn)突變序列的donor oligo (ssODN)替換WT對(duì)應(yīng)的堿基。

·? 細(xì)胞疾病模型修復(fù)

通過(guò)HDR，攜帶WT序列的donor oligo (ssODN)替換對(duì)應(yīng)的突變堿基。

應(yīng)用案例：

PSEN1基因A79V突變可引起阿爾茨海默癥。研究表明，將阿爾茨海默癥患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞（iPSC），然后通過(guò)用野生型序列替換點(diǎn)突變序列，修正突變的基因。通過(guò)研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知該突變對(duì)細(xì)胞表型的影響，從而深入研究該突變的病理性作用。

用于修復(fù)A79V-hiPSC點(diǎn)突變的gRNA序列和ssODN。

·? A 突變位點(diǎn)附近的基因組序列：紅色的T是需要被修正的核苷酸；黃色的是sgRNA識(shí)別位點(diǎn)，加粗的AA是Cas9的切割位點(diǎn)；粉紅色的是正反向引物。

·? B Donor oligo序列, 綠色的C是修正后的核苷酸。

iPSC中PSEN1基因的序列分析。

·? A 點(diǎn)突變修正后的雜合子測(cè)序結(jié)果。

·? B 點(diǎn)突變修正后的純合子測(cè)序結(jié)果（T>C）。

參考文獻(xiàn)：

Pires, C., Schmid, B., Petr?us, C., Poon, A., Nimsanor, N., Nielsen, T. T., ... & Freude, K. K. (2016). Generation of a gene-corrected isogenic control cell line from an Alzheimer's disease patient iPSC line carrying a A79V mutation in PSEN1.?Stem cell research,?17(2), 285-288.

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