這次的升級(jí)版新冠讓我們更加意識(shí)到防疫的重要性。只要疫情沒有完全控制住就不能松懈，除此之外，對(duì)于病毒的診斷也是至關(guān)重要的。那么病毒RNA的提取就顯得十分關(guān)鍵。這里amyjet為大家整理了10種常見的核酸純化方法，重點(diǎn)是病毒RNA的分離。

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一、過濾

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膜過濾是一種物理分離技術(shù)，根據(jù)膜的性質(zhì)（例如，孔隙率）和液體含量（例如，粒度），液體的內(nèi)含物通過或被膜排除。通過選擇具有適當(dāng)孔徑的膜，可以過濾液體病毒樣本以排除細(xì)胞和其他大型非病毒污染物。

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二、核酸酶處理

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衣殼和包膜為病毒基因組提供了額外的保護(hù)層，防止核酸酶降解。DNAse和RNAse通常用于消除外源核酸，同時(shí)受保護(hù)的病毒基因組保持完整。

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三、苯酚/氯仿抽提

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可以使用苯酚/氯仿提取方法從病毒RNA基因組中分離宿主來源的基因組DNA和小RNA，該方法涉及將DNA?和RNA分別分為有機(jī)相和水相。首先，通過向含有核酸的樣品中加入酸性苯酚和酸性緩沖液來產(chǎn)生單相溶液。氯仿的加入創(chuàng)建了一個(gè)雙相系統(tǒng)，其中DNA和蛋白質(zhì)分配到下層有機(jī)相，而上層水相保留RNA。水相可以另外用異丙醇處理，并通過基于硅膠柱的純化處理，以提取總?RNA?或單個(gè)小RNA（miRNA、tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA）和大RNA（mRNA、18SrRNA、28SrRNA）?, snRNA)?分子，這取決于乙醇的濃度。

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四、離心

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低速離心：（例如，4℃下6000?×g10分鐘)是一種簡(jiǎn)單方便的病毒凈化方式。細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片被沉淀，上清液中懸浮的病毒粒子可以進(jìn)行更嚴(yán)格的純化。

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超速離心：病毒的大小和密度不同于細(xì)胞器（例如線粒體、核糖體、細(xì)胞核）、生物大分子（例如?DNA、RNA、蛋白質(zhì)）和污染病毒樣本的其他宿主成分。超速離心利用這些物理化學(xué)特性將病毒與非病毒元素分離。這種分離通常是通過結(jié)合蔗糖和氯化銫密度梯度來實(shí)現(xiàn)的。在超速離心之前，細(xì)胞碎片在初始離心步驟中被清除。通過首先應(yīng)用蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步去除剩余的雜質(zhì)，該離心基于顆粒的?S?值或沉降系數(shù)進(jìn)行分離。然后將氯化銫密度梯度平衡離心（根據(jù)其浮力密度分離顆粒）應(yīng)用于所得病毒粗級(jí)分，以獲得純化的病毒片段。

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五、沉淀

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儲(chǔ)存或下游應(yīng)用（如感染和病毒基因組分離）通常需要濃縮的病毒制備物。已經(jīng)開發(fā)出沉淀方法，以根據(jù)在無機(jī)鹽或聚醚化合物（例如硫酸銨、PEG-6000）溶液中的溶解度，快速、輕松且廉價(jià)地濃縮病毒并去除雜質(zhì)。例如，據(jù)報(bào)道，在40%的飽和度水平下，硫酸銨會(huì)從補(bǔ)充有?10% FCS?的細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)病毒沉淀，其中大部分(85%)?的蛋白質(zhì)保持溶解狀態(tài)。

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六、柱層析

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有多種色譜樹脂（例如，蛋白A、陰離子交換、陽離子交換）可用，取決于色譜操作參數(shù)（例如，樹脂類型；緩沖液組成和?pH值等），可用于將病毒與宿主分離核酸、蛋白質(zhì)等。然而，這些方法需要昂貴的儀器、復(fù)雜的協(xié)議、專業(yè)的技術(shù)知識(shí)和訓(xùn)練有素的操作人員。

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七、VIDISCA

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基于cDNA擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)的病毒發(fā)現(xiàn)方法，或簡(jiǎn)稱VIDISCA，允許優(yōu)先擴(kuò)增病毒核酸。血漿/血清和培養(yǎng)物上清輸入樣品已使用該方法成功測(cè)試。在典型的VIDISCA?方案中，病毒核酸首先通過離心和DNase處理選擇性富集，以消除細(xì)胞、線粒體及其相關(guān)的遺傳內(nèi)容。然后提取封裝的病毒基因組。對(duì)于冠狀病毒等單鏈RNA病毒，需要使用隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟，然后是互補(bǔ)DNA的第二鏈合成。得到的雙鏈DNA (dsDNA)?通過苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀進(jìn)行純化。純化的dsDNA隨后用限制酶處理，這些酶消化幾乎所有病毒中存在的短識(shí)別序列。

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大約80%的細(xì)胞總?RNA?是核糖體(rRNA)，宿主來源的RNA構(gòu)成了人類血漿樣本中的大部分?RNA。因此，對(duì)VIDISCA協(xié)議進(jìn)行了修改，加入了選擇性rRNA消耗，以提高檢測(cè)靈敏度和特異性。rRNA逆轉(zhuǎn)錄阻斷寡核苷酸以及不能與rRNA退火的非隨機(jī)六聚體的使用已被證明可以抑制非病毒cDNA合成并減少背景擴(kuò)增。

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八、用rRNA特異性DNA“剪刀探針”

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選擇性去除rRNA核糖體RNA污染也可以用rRNA雜交寡核苷酸探針和伴隨的核酸酶介導(dǎo)的雜交消化。這些合成探針旨在補(bǔ)充特定的rRNA序列。RNase H處理導(dǎo)致rRNA/DNA雙鏈體中rRNA的靶向切割，而DNase I用于去除殘留探針。然后可以對(duì)去除了rRNA?的樣品進(jìn)行下游純化。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，rRNA被特異性切割，同時(shí)保留了非雜交RNA?的完整性。

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九、使用體外細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)增病毒

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鑒于病毒通常產(chǎn)生的滴度低，體外細(xì)胞培養(yǎng)物用于將病毒粒子擴(kuò)增至分析相關(guān)的量。接種的?Vero和HEK293T細(xì)胞已有效用于病毒擴(kuò)增目的。該方法包括在接種后24小時(shí)更換培養(yǎng)基，然后在另一個(gè)24小時(shí)孵育后從上清液中收集受感染細(xì)胞釋放的病毒粒子。

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十、商業(yè)病毒?RNA?提取試劑盒

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基于柱和磁珠的方法為從臨床標(biāo)本中提取病毒?RNA?基因組提供了一種快速方便的方法。Epigentek提供各種用于分離RNA的磁珠和離心柱試劑盒來自不同樣本來源（細(xì)胞、組織、全血、唾液、鼻咽拭子）和物種（病毒、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、植物）。去污劑和離液鹽用于裂解細(xì)胞和滅活?RNase。當(dāng)污染物通過時(shí)，專門的高鹽緩沖系統(tǒng)允許RNA堿基與磁珠或離心柱的玻璃纖維基質(zhì)結(jié)合。雜質(zhì)被有效地洗掉，純核酸用水性緩沖液洗脫，無需苯酚提取或醇沉。這些試劑盒是下游PCR分析的理想選擇；靶向病毒基因組的引物可與擴(kuò)增宿主?DNA RNase P?基因的引物結(jié)合使用，該基因也與柱/珠結(jié)合并用作內(nèi)部或提取控制。

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zui后我們來說一下艾美捷病毒RNA提取用到的相關(guān)科研工具：

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1.P-9107?EpiQuik?病毒?RNA?分離快速試劑盒：只需?10?分鐘即可快速純化病毒?RNA

2.P-9108?EpiMag?病毒?RNA?分離試劑盒（磁珠）：通過磁珠形式在?25?分鐘內(nèi)快速分離病毒?RNA。

3.P-9109?EpiMag 96?孔病毒?RNA?提取試劑盒（高通量）：通過磁珠形式在?30?分鐘內(nèi)高通量分離病毒?RNA，適用于自動(dòng)化設(shè)置。

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EpiQuik?病毒?RNA?分離快速試劑盒結(jié)果分析：

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當(dāng)然，當(dāng)上述方法單獨(dú)進(jìn)行不足以充分純化病毒時(shí)，方法組合是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。專注于病毒表觀基因組的研究需要高純度的輸入材料，不受宿主?DNA、RNA?或蛋白質(zhì)的表觀遺傳修飾的干擾。上述方法的組合可以提高病毒回收率、產(chǎn)量和質(zhì)量。舉例來說，可以擴(kuò)增低滴度?RNA?病毒，然后從接種的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中回收。在核酸酶處理和離心去除宿主污染物之后，可以使用商業(yè)分離試劑盒提取病毒基因組，用于下游m6A RNA?甲基化分析。