所有的細(xì)胞培養(yǎng)基都需要相似的基本營養(yǎng)物質(zhì)，對維持生命和細(xì)胞生長至關(guān)重要?；诩?xì)胞的化學(xué)組成，水，各種來源的碳、氮和磷酸鹽，氨基酸，脂肪酸，維生素，微量元素，和鹽濃度都提供所需的濃度，以滿足細(xì)胞的生長,。根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率，需要補(bǔ)充關(guān)鍵組分以保持細(xì)胞的高活力，并延長培養(yǎng)時(shí)間。雖然已經(jīng)開發(fā)出了適合多種細(xì)胞類型的培養(yǎng)基，包括微生物，植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物，不同的培養(yǎng)基在基本營養(yǎng)成分方面可能大體相似，但本章節(jié)主要關(guān)注無血清、化學(xué)成分限定的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基，主要是為了重組抗體的表達(dá)。

作為在大規(guī)模動(dòng)物培養(yǎng)中不可缺少的因素之一，培養(yǎng)基對細(xì)胞的狀態(tài)，高密度的維持以及產(chǎn)量都發(fā)揮著重要的作用。

為支持細(xì)胞生長，所有培養(yǎng)基都包含基本的營養(yǎng)物質(zhì)，水，碳源，氮源，維生素，氨基酸，脂肪酸，微量元素，磷酸鹽。培養(yǎng)基含有超過70 種營養(yǎng)成分，對各種成分進(jìn)行合理組合成為優(yōu)化的關(guān)鍵，在此之前，需要了解培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。培養(yǎng)基中各主要組分如下：

1?水

哺乳動(dòng)物細(xì)胞對水中的雜質(zhì)高度敏感，包括內(nèi)毒素，細(xì)菌，微量元素，微量有機(jī)物等。為了防止雜質(zhì)對細(xì)胞培養(yǎng)基的污染，以及培養(yǎng)基中未控制的離子和微量元素的濃度造成細(xì)胞性能的不一致，需要用高純水用于培養(yǎng)基的配置。一般來說，純水系統(tǒng)包括蒸餾，去離子，微濾，反滲透處理。水的純度一般用電導(dǎo)率或電阻(>18MΩcm)衡量或低有機(jī)碳含量(≤15ppb)，而且必須不含有內(nèi)毒素。常用的是注射用水，高純度且無內(nèi)毒素。

2 氨基酸

氨基酸可以分為必須氨基酸(用于維持活細(xì)胞的氮元素平衡) 和非必需氨基酸(可以由前體細(xì)胞合成)。

必須氨基酸：組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯基丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺。

非必須氨基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，脯氨酸，絲氨酸，酪氨酸[1]。

非必須氨基酸在細(xì)胞密度較低對細(xì)胞生長不會產(chǎn)生影響，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生這些氨基酸的速度無法滿足自身生長的需求，會成為限速因素，甚至導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡。如L-天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸是大多數(shù)CHO細(xì)胞系的自限氨基酸。不同的細(xì)胞以不同的速率利用這些氨基酸，并不是所有的商業(yè)化培養(yǎng)基都含有全部的非必須氨基酸，因此需要在培養(yǎng)初期對培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

培養(yǎng)基中氨基酸濃度的小改變都會影響細(xì)胞的密度和生長，抗體糖基化。在融合蛋白表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)通過代謝流組學(xué)分析優(yōu)化氨基酸的濃度可以提高細(xì)胞密度50%，產(chǎn)量提高25%。在一個(gè)更加復(fù)雜的研究中，Torkashvand通過幾個(gè)Plackett-Burman (PB)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了影響細(xì)胞密度和產(chǎn)量的關(guān)鍵氨基酸的濃度，再通過響應(yīng)面法分析了這些氨基酸的交互效應(yīng)，在不影響抗體質(zhì)量的情況下，抗體表達(dá)量提高了70%。

除了提高細(xì)胞密度和抗體產(chǎn)量，一些氨基酸的添加對反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞還有保護(hù)作用，減輕或消除氨和PCO?的負(fù)面效應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對培養(yǎng)中產(chǎn)生的氮缺乏，高滲透壓和高PCO?。Vivian M研究了在高PCO?環(huán)境壓力下哪些氨基酸具有保護(hù)效應(yīng)[2]。PCO?的增加會抑制細(xì)胞的生長，同時(shí)伴隨著胞內(nèi)pH和糖酵解的下降。通過研究每種氨基酸在三種濃度梯度(5mM 15mM 25mM)對高PCO?和高滲透壓環(huán)境下( 195mm Hg PCO?/435mOsm)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，對照環(huán)境為40mm Hg PCO?/320mOsm。在hybridoma和CHO細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)效應(yīng)的四種氨基酸，甘氨酸甜菜堿，甘氨酸，天冬酰胺，蘇氨酸。Hybridoma細(xì)胞中，這四種物質(zhì)還增加了葡萄糖的消耗速率。在CHO細(xì)胞中，PCO2的增加降低了tPA的生產(chǎn)率，15mM甘氨酸甜菜堿glycine betaine在高PCO2和高滲透壓環(huán)境下提高了20%的生產(chǎn)率，以及葡萄糖的消耗速率。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中Na+和Cl-濃度增加，許多信號分子包括酶和RNA是不穩(wěn)定的，而細(xì)胞內(nèi)這些保護(hù)性的氨基酸的積累可以降低胞內(nèi)有機(jī)離子Na+和Cl-的積累，并穩(wěn)定胞內(nèi)分子。

氨基酸還可以作為信號分子降低細(xì)胞凋亡速度[3]。防止細(xì)胞凋亡的氨基酸有甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸。通過添加丙氨酸（2mM），谷氨酰胺，天冬酰胺可以降低凋亡速度，提高穩(wěn)態(tài)活細(xì)胞濃度。

在CHO-K1細(xì)胞中，當(dāng)亮氨酸濃度低于10uM，缺乏亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸可以提高轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)L的活性1-4倍，以及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)L相關(guān)氨基酸的利用速度，隨之而來的就會促進(jìn)這些氨基酸的更快速率的消耗。因此這四種氨基酸的濃度需要比代謝通量或組學(xué)分析中計(jì)算出的需求濃度更高，并在培養(yǎng)中仔細(xì)監(jiān)控濃度變化[4]。

氨基酸的氧化導(dǎo)致二級和三級結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致生物學(xué)后果，包括活性和半衰期的降低，更快的清除和免疫原性聚集體的形成。美國禮來公司發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用CD培養(yǎng)基代替含有水解物的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO K1SV細(xì)胞時(shí)，可以提高產(chǎn)量40%，但是使用LC=MS肽圖分析表明在抗體分子的互補(bǔ)決定區(qū)發(fā)現(xiàn)有特定的色氨酸殘基氧化大幅度增加。研究發(fā)現(xiàn)通過增加色氨酸，銅離子和錳離子在CD培養(yǎng)基和補(bǔ)料中的濃度，降低補(bǔ)料中半胱氨酸的含量，可以不影響細(xì)胞生長和表達(dá)，降低色氨酸氧化60%，并在反應(yīng)器中得到重復(fù)驗(yàn)證。通過使用優(yōu)化的培養(yǎng)基和補(bǔ)料，發(fā)現(xiàn)8%的酸性峰會轉(zhuǎn)變?yōu)橹鞣?，抗體純度和糖基化不變[5]。銅離子和鐵離子也會促進(jìn)蛋白的氧化，此研究中相反的結(jié)果是因?yàn)镃u+催化ROS，而一定濃度的Cu2+(硫酸銅)可以壓制還原劑。錳離子與鐵離子競爭阻止Fenton反應(yīng)，進(jìn)而阻止ROS形成，錳離子還會影響糖基化。半胱氨酸一般被認(rèn)為是抗氧化劑，但它的作用是隨著濃度和輔因子上的分布而變化的。在此研究中的解釋是，半胱氨酸作為過渡金屬的還原劑，催化產(chǎn)生ROS的Fenton反應(yīng)，因此通過降低半胱氨酸，可以降低導(dǎo)致色氨酸氧化的ROS量。

培養(yǎng)基中高濃度的賴氨酸和組氨酸能有效的降低抗體中的酸性峰，同時(shí)不影響產(chǎn)量。高濃度的賴氨酸和組氨酸還可以稍微降低指數(shù)生長期的細(xì)胞密度，提高培養(yǎng)后期抗體生產(chǎn)階段的細(xì)胞活力。然而，高濃度的賴氨酸對羧肽酶有抑制作用，導(dǎo)致C端賴氨酸變體。因此，需要根據(jù)單位抗體需求量改變兩種氨基酸濃度。

培養(yǎng)基中丙氨酸的濃度都相對較低，在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞消耗丙氨酸速率低或利用其他氨基酸生成丙氨酸。當(dāng)培養(yǎng)基中乳酸足夠多時(shí)，丙氨酸的產(chǎn)生速率與氨基酸的濃度呈正相關(guān)。丙氨酸的積累對細(xì)胞的生長幾乎沒有抑制作用，除非丙氨酸的濃度超過3mM。當(dāng)乳酸和丙酮酸缺乏時(shí)，通過谷氨酸降解，丙氨酸傾向于轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵⑨尫虐钡脚囵B(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中氨的積累[6]。

在抗體表達(dá)過程中，CHO細(xì)胞以較高的速率消耗精氨酸。精氨酸的缺乏會導(dǎo)致指數(shù)生長期的CHO細(xì)胞阻滯在GO或G1期，過多的精氨酸可以有效的降低抗體的酸性峰比例。然而，不同于賴氨酸，高濃度的精氨酸會抑制細(xì)胞生長，降低細(xì)胞活力。另外，精氨酸濃度的增加還會雙倍提高C端賴氨酸變體的數(shù)量，從而增加產(chǎn)品的異質(zhì)性。

天冬酰胺和天冬氨酸是培養(yǎng)基中重要的非必須氨基酸，在關(guān)鍵代謝途徑中起著重要的作用。相比較其他氨基酸，細(xì)胞消耗天冬酰胺和天冬氨酸速率更高，尤其是在指數(shù)生長期。這兩種氨基酸同葡萄糖，谷氨酰胺，谷氨酸在三羧酸循環(huán)和能量代謝中都很重要[7]。天冬氨酸和天冬酰胺通過轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)在谷氨酰胺和谷氨酸之間的轉(zhuǎn)變中作為氨的供體和受體，并產(chǎn)生谷氨酸和草酰乙酸[8]。

當(dāng)缺乏天冬酰胺，細(xì)胞會用更高濃度的天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，谷氨酰胺，精氨酸來補(bǔ)償，甚至?xí)酶叩乃俾氏陌被幔瑢?dǎo)致的氨基酸可利用的降低會影響蛋白合成和基因表達(dá)[9]。培養(yǎng)基中天冬酰胺和天冬氨酸的缺乏對CHO細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體的產(chǎn)生有害。細(xì)胞在生長期時(shí)天冬酰胺的缺乏是抗體多肽序列中天冬酰胺位點(diǎn)絲氨酸的錯(cuò)誤加入的主要原因。而且天冬酰胺在抑制DNA損傷和細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。培養(yǎng)基中天冬酰胺的濃度可以調(diào)整抗體的半乳糖基化糖型分布。低濃度的天冬酰胺可以降低氨的積累和胞內(nèi)ph，隨后增加了β-1,4半乳糖轉(zhuǎn)移酶的活性和表達(dá)，導(dǎo)致G0F轉(zhuǎn)變?yōu)镚1F/G2F[10]。補(bǔ)料中提高天冬酰胺的濃度雖然提高了乳酸和氨，但最終提高了產(chǎn)量?？梢酝ㄟ^提高補(bǔ)料中天冬酰胺/谷氨酰胺的比例降低氨的濃度。

作為唯一一個(gè)含巰基的氨基酸，半胱氨酸是一個(gè)特殊的非必須氨基酸。半胱氨酸殘基上巰基間的二硫鍵的形成支持CHO細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和重組抗體三級和四級結(jié)構(gòu)的折疊。半胱氨酸的缺乏對CHO細(xì)胞的生長是致命的且不可逆轉(zhuǎn)的，導(dǎo)致細(xì)胞活力3天內(nèi)下降40%。當(dāng)半胱氨酸濃度下降到0.1mM，單克隆抗體表達(dá)量下降40%，半胱氨酸的濃度大于1mM對哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，這可能是由于脂質(zhì)過氧化和羥基自由基的形成，在銅離子的存在下會加速此形成[11]。在哺乳動(dòng)物中，半胱氨酸的濃度由肝臟調(diào)節(jié)，在培養(yǎng)基中沒有此調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)，培養(yǎng)基中半胱氨酸的濃度需要被仔細(xì)設(shè)計(jì)和控制。半胱氨酸是培養(yǎng)基中最不穩(wěn)定的氨基酸，在ph中性時(shí)可以氧化成為胱氨酸，胱氨酸的低溶解度也會降低培養(yǎng)基中半胱氨酸的溶解度，Merck的S-磺基半胱氨酸可以作為培養(yǎng)基中半胱氨酸的替代物和抗氧化劑，增加二硫鍵，降低聚體[12]。

CHO細(xì)胞以相對較低的速度消耗甘氨酸，在培養(yǎng)基優(yōu)化效果研究中也不是一個(gè)主要的成分。在CHO細(xì)胞中，甘氨酸是胸苷合成的副產(chǎn)物。在CHO DG44(DHFR缺陷型)細(xì)胞中，阻斷胸苷的生物合成導(dǎo)致甘氨酸的缺乏。因此在培養(yǎng)DG44的CHO細(xì)胞系的含有MTX的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，需要仔細(xì)設(shè)計(jì)甘氨酸的濃度。

絲氨酸是CHO細(xì)胞消耗第二高的氨基酸。CHO細(xì)胞會消耗70%的絲氨酸生成甘氨酸，促進(jìn)胸苷的合成[13]。盡管絲氨酸很重要，培養(yǎng)基中絲氨酸的濃度低到1mM并未影響細(xì)胞生長，只降低了指數(shù)生長期甲酸和甘氨酸的產(chǎn)生，但培養(yǎng)基中絲氨酸的耗竭產(chǎn)生了負(fù)效應(yīng)，包括促進(jìn)天冬氨酸的消耗，丙氨酸，乳酸和氨的產(chǎn)生，最終抑制細(xì)胞的生長[14]。所以在培養(yǎng)基中絲氨酸一般設(shè)定在相對較高的濃度，一些研究也表明，絲氨酸的添加可以提高產(chǎn)量和最高活細(xì)胞密度。

酪氨酸是CHO細(xì)胞表達(dá)抗體的關(guān)鍵氨基酸。低濃度的酪氨酸會干擾蛋白質(zhì)翻譯，降低抗體單位生產(chǎn)率[15]。酪氨酸缺乏與苯丙氨酸錯(cuò)誤插入到酪氨酸殘基上呈正相關(guān)，從而導(dǎo)致產(chǎn)品序列變體的產(chǎn)生。保持酪氨酸的濃度在1mM以上可以有效清除酪氨酸位點(diǎn)上的錯(cuò)誤插入[16]。然而酪氨酸是難溶的氨基酸，但是在培養(yǎng)基中又需要高濃度的酪氨酸。Merck的磷酸化酪氨酸或者含有酪氨酸的二肽可以提高了酪氨酸的溶解度[17]。

3 維生素

培養(yǎng)基中包含的維生素包括B-復(fù)合維生素葉酸，煙酰胺，吡哆醛，泛酸鹽，核黃素和硫胺，這些都是輔酶的組成成分，以及膽堿和肌醇作為脂質(zhì)合成的基質(zhì)。維生素的高還原能力可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化自由基的傷害。盡管需求量是微量的，維生素是培養(yǎng)基中的必須成分，尤其是在CD培養(yǎng)基中。許多商業(yè)培養(yǎng)基中都包含B族維生素及其衍生物，包括生物素，葉酸，肌醇，煙酰胺，膽堿，4-氨基苯甲酸，泛酸，吡哆醇，核黃素，硫胺素和鈷胺素。維生素的添加可以CHO細(xì)胞表達(dá)mAb單位產(chǎn)量3倍以上。隨著培養(yǎng)基中所有維生素濃度的增加，添加葉酸，鈷胺素，生物素和4-氨基苯甲酸可以提高細(xì)胞生長密度和表達(dá)量。

許多維生素都會強(qiáng)光，高溫，長期的空氣暴露敏感，在培養(yǎng)基中由于含有鐵和胱氨酸的存在，吡哆醛會隨著時(shí)間的推移形成沉淀。用吡哆醇取代吡哆醛則可以顯著改善保質(zhì)期。對于低密度生長的細(xì)胞，維生素B12是非常重要的?？箟难峄蚓S生素C在適合細(xì)胞生長的pH和溫度下是非常不穩(wěn)定的，硫胺素和泛酸對熱敏感。抗壞血酸和生育酚對空氣氧化敏感?？梢杂每箟难?-磷酸鎂鹽替代。一些B族維生素如核黃素，葉酸，亞葉酸和B12，硫胺素和鈷胺素，抗壞血酸對于光線是非常敏感的，含有這些維生素的培養(yǎng)基需要避光保存，否則這些成分會很快降解。因此，培養(yǎng)基的保存必須注意暗光和低溫保存。

4 微量元素

培養(yǎng)基中的微量元素有效濃度非常低，有時(shí)甚至低于標(biāo)準(zhǔn)分析儀器的檢測闕值。一些微量元素在調(diào)整代謝通路，酶和信號分子活性上起著非常關(guān)鍵的作用。

5 葡萄糖等能源物質(zhì)

葡萄糖和谷氨酰胺是培養(yǎng)基中兩種主要的能源物質(zhì)。葡萄糖是核苷，氨基糖和一些氨基酸的碳源。CHO通過糖酵解利用1M葡萄糖生成丙酮酸，再通過檸檬酸循環(huán)氧化丙酮酸生成36M ATP。葡萄糖通過分解代謝產(chǎn)生ATP，在大多數(shù)培養(yǎng)基中，只有5%的ATP來自于三羧酸循環(huán)的有氧糖酵解過程，副產(chǎn)物是二氧化碳。丙酮酸也可以被認(rèn)為是能源物質(zhì)，因?yàn)樗谕ㄟ^TCA循環(huán)產(chǎn)生ATP中起著關(guān)鍵作用。由于氧吸收的限制，80%的葡萄糖會通過厭氧糖酵解轉(zhuǎn)為乳酸，乳酸鹽改變ph和滲透壓，是細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要重點(diǎn)監(jiān)控的代謝副產(chǎn)物之一，高濃度的乳酸會抑制細(xì)胞生長。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)早期，葡萄糖的濃度并不會顯著影響乳酸的產(chǎn)生速率，而在培養(yǎng)的中后期，高濃度的葡萄糖會導(dǎo)致乳酸積累的增加。為了降低葡萄糖代謝的副產(chǎn)物，已經(jīng)研究了一些替代葡萄糖的能源物質(zhì)。

在CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，半乳糖是一個(gè)重要的可選擇的碳源，在糖酵解中也可生成丙酮酸。通過分析半乳糖的代謝途徑發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)含有葡萄糖和半乳糖時(shí)，細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖，然后利用半乳糖，這樣導(dǎo)致了更低的乳酸積累和更高的乳酸消耗，也延遲了細(xì)胞活力的下降。而完全用半乳糖替代葡萄糖，雖然氨和乳酸濃度下降，卻導(dǎo)致細(xì)胞密度下降，以及細(xì)胞活力提前下降，這或許是因?yàn)榘肴樘羌っ傅牡突钚?。半乳糖同時(shí)會影響與糖基化相關(guān)基因的表達(dá)。通過調(diào)整培養(yǎng)基中半乳糖，尿苷，氯化錳可以調(diào)整抗體的半乳糖基化水平。通過兩種不同的機(jī)制，半乳糖的添加還會影響抗體的唾液酸化。通過增加額外的唾液酸化位點(diǎn)，增加的半乳糖基化也增加了唾液酸化水平。然而，唾液酸酶基因表達(dá)譜和細(xì)胞內(nèi)酶活性研究表明半乳糖的增加也會提高去唾液酸化水平。

CHO培養(yǎng)基中，還有其他己糖可以用來替代葡萄糖。包括果糖，甘露糖等。使用甘露糖替代葡萄糖，促進(jìn)細(xì)胞生長，降低乳酸積累，而不改變抗體結(jié)構(gòu)，從而提高單位生產(chǎn)率。然而，培養(yǎng)基中含有高濃度的甘露糖，不僅會抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)α-甘露糖苷酶，還會增加抗體甘露糖基化水平，因此導(dǎo)致ADCC活性提高和人體內(nèi)抗體的清除速率。同葡萄糖和半乳糖一樣，果糖的添加也可以降低乳酸的濃度，延遲細(xì)胞活力下降。然而，果糖完全代替葡萄糖時(shí)，也會導(dǎo)致細(xì)胞密度和產(chǎn)量的下降。

對于大多數(shù)正常的細(xì)胞來說，大約一半的能量來自葡萄糖，一半來自L-谷氨酰胺。

L-谷氨酰胺的問題在于它會隨著時(shí)間的推移和溫度的變化分解為氨和吡絡(luò)烷酮羧酸。L-谷氨酰胺在室溫(25℃)條件下就會加速分解，在冷凍溫度下，大約30%的谷氨酰胺也會在6個(gè)月內(nèi)消耗殆盡。所以谷氨酰胺配置200mM一般分裝保存在-20℃，有效期盡量在6個(gè)月以內(nèi)。在37℃，谷氨酰胺在2-3天內(nèi)耗盡，產(chǎn)生的氨影響細(xì)胞生長。當(dāng)氨的濃度達(dá)到10mM，對動(dòng)物細(xì)胞會有毒害作用。

在抗體表達(dá)階段可以通過添加谷氨酸替代谷氨酰胺降低氨和乳酸的產(chǎn)生速率，在含有谷氨酸的培養(yǎng)基中，通過優(yōu)化葡萄糖的濃度，可以提高葡萄糖和氮源的利用率，同時(shí)降低氨和乳酸的積累。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，丙酮酸作為一種能源物質(zhì)也可以替代谷氨酰胺降低氨的積累。因?yàn)楸崾侨樗岙a(chǎn)生的一個(gè)中間體，同時(shí)也是丙氨酸脫氫反應(yīng)的產(chǎn)物，在培養(yǎng)基中添加丙酮酸，在乳酸耗盡時(shí)抑制丙氨酸的消耗，降低丙氨酸代謝產(chǎn)生的氨[18]。

6 緩沖體系

平衡鹽溶液主要含有陰陽離子以及離子緩沖對，用以保持細(xì)胞生理所需的pH范圍。生理溶液中四種主要陽離子是鈉(Na+)，鉀(K+)，鈣(Ca2+)，鎂(Mg2+)。所有這四種離子對維持膜電位和養(yǎng)分運(yùn)輸很重要。陽離子Na+和K+在確定滲透壓和維持滲透平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。陽離子Ca2+和Mg2+作為細(xì)胞彼此貼附的基質(zhì)非常重要，并且是作為酶反應(yīng)的輔助因子。

平衡溶液中的主要陰離子是磷酸鹽(PO4-)，氯化物(Cl-)和碳酸氫鹽(HCO3-)。這些陰離子在緩沖體系中扮演著重要的角色，用以維持細(xì)胞的7.2-7.6的最佳pH值?；A(chǔ)培養(yǎng)基中一般選擇有機(jī)磷酸鹽和兩性離子緩沖鹽作為緩沖體系。當(dāng)使用碳酸氫鈉的培養(yǎng)基時(shí)，二氧化碳的最佳比例因培養(yǎng)基的配方而異。一般來說，對于含有2-3g/L的碳酸氫鹽的培養(yǎng)基，溫度在36-37℃時(shí)，培養(yǎng)箱或搖床氣體環(huán)境中CO2含量控制在6%，培養(yǎng)基應(yīng)該能達(dá)到適合細(xì)胞生長的pH值。

7 脂類

脂質(zhì)是膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也是能量的來源，并且還是細(xì)胞信號，轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成的重要組成成分。脂類也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的關(guān)鍵組分，是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成，折疊，翻譯后修飾以及分泌的細(xì)胞器。通常，CHO細(xì)胞自己可以合成脂質(zhì)，重組CHO細(xì)胞可以適應(yīng)并在無脂質(zhì)的培養(yǎng)基中生長，并且沒有明顯的細(xì)胞增殖速率和抗體表達(dá)的下降。然而，研究表明，在無血清的培養(yǎng)基中添加脂質(zhì)對細(xì)胞活力和抗體糖基化有益。實(shí)際上，脂質(zhì)和脂質(zhì)前體對CHO細(xì)胞生長的效果是視添加的兩者類型而定的。磷脂是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要成分，無論無血清培養(yǎng)基中是否含有生長因子，磷脂的補(bǔ)充，如磷脂酸或溶血磷脂酸，已證實(shí)可以促進(jìn)CHO的生長。作為磷脂的主要成分，與混合脂類相比，膽堿和乙醇胺能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長。一些經(jīng)典的培養(yǎng)基如DMEM和RPMI-1640中也含有膽堿。

脂肪酸和膽固醇在培養(yǎng)基中溶解度不高，并且不穩(wěn)定。脂肪酸和膽固醇的不同前體和類似物作為替代也對細(xì)胞的生長和良好狀態(tài)有益。培養(yǎng)基中少量的乙醇可以增加脂質(zhì)的溶解度而不影響細(xì)胞的生長。盡管培養(yǎng)基中脂肪酸的添加很重要，但高濃度的脂肪酸會引起CHO細(xì)胞的脂毒性，因此脂肪酸仍需要維持在較低的水平。

8 多胺類

圖1 多胺的功能

多胺是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的分子，在多種代謝中起著關(guān)鍵的作用，包括DNA合成和轉(zhuǎn)錄，核糖體功能，離子通道調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。幾種多胺都是由尿素循環(huán)的中間體鳥氨酸合成的。培養(yǎng)基中添加多胺對支持和促進(jìn)細(xì)胞生長都至關(guān)重要。

圖2 多胺結(jié)構(gòu)、生物合成和相互轉(zhuǎn)化

CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中的多胺一般包括腐胺，亞精胺和精胺。腐胺是合成亞精胺和精胺的前體，亞精胺和精胺在細(xì)胞中可以相互轉(zhuǎn)換。這三個(gè)多胺均可以提高細(xì)胞活力和密度，精胺是效果最顯著的。許多CHO培養(yǎng)基中都含有不同的多胺，多胺的分解代謝會產(chǎn)生氧化類物質(zhì)，包括醛類，丙烯醛和氨，這些物質(zhì)會影響細(xì)胞的生長，最終影響細(xì)胞的活力。因此，培養(yǎng)基中多胺的添加要控制在細(xì)胞毒性的下限濃度。

9?培養(yǎng)環(huán)境

滲透壓是培養(yǎng)基的一個(gè)重要參數(shù)，所有離子，包括鹽，脂肪酸，氨基酸，緩沖液，都會影響滲透壓，當(dāng)滲透壓高于450 mOsm/kg，會導(dǎo)致細(xì)胞密度，產(chǎn)量和活力的下降，細(xì)胞直徑和倍增時(shí)間的延長[20]。當(dāng)滲透壓低于450 mOsm/kg，滲透壓的增加對細(xì)胞的生長影響微弱，在抗體表達(dá)階段，高滲透壓（最大到400mOsm/kg）提高抗體表達(dá)量20%，滲透壓提高到450就會導(dǎo)致乳酸和氨的積累顯著增加。因此CHO細(xì)胞的傳代和表達(dá)培養(yǎng)基滲透壓一般在250-350mOsm/kg，補(bǔ)料培養(yǎng)基會在培養(yǎng)后期提高滲透壓。

工程問題也是培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的一個(gè)重要方面。機(jī)械攪拌，起泡產(chǎn)生的剪切力會損害細(xì)胞，在CD培養(yǎng)基中尤其明顯。起泡會導(dǎo)致排氣管堵塞，壓力過大或者污染。Pluronic F-68和消泡劑可以降低剪切力傷害，控制起泡。因此，優(yōu)化Pluronic F-68和消泡劑的濃度以最大程度的避免剪切力和泡泡的傷害，同時(shí)最小化對反應(yīng)器中氧傳遞系數(shù)和Kla的負(fù)面影響。

10 展望

可以良好支撐細(xì)胞表達(dá)和生長的培養(yǎng)基需要考慮到方方面面，通過不斷優(yōu)化組成成分，物理化學(xué)特性，獲得能進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)抗體的穩(wěn)定的培養(yǎng)基。更好的理解培養(yǎng)基才能促使培養(yǎng)基的發(fā)展，使不同的細(xì)胞系獲得高表達(dá)和產(chǎn)品質(zhì)量。細(xì)胞培養(yǎng)基已經(jīng)從早期含有血清的培養(yǎng)基發(fā)展到了復(fù)雜的含有水解物的培養(yǎng)基，完全化學(xué)成分限定的無蛋白的培養(yǎng)基配方。通過平衡基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成，優(yōu)化細(xì)胞吸收到的營養(yǎng)成分，控制最終的滲透壓，通過化學(xué)計(jì)量方式的補(bǔ)料方式，共同優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基組成，以最大限度的提高表達(dá)和一致性。

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