人類基因組的測(cè)序結(jié)果顯示，負(fù)責(zé)編碼蛋白的基因大約有2萬(wàn)多個(gè)，占全基因長(zhǎng)度的不到2%。而許多低等原生生物也擁有2萬(wàn)多個(gè)編碼蛋白的基因，但與人類不同的是，這些低等生物體內(nèi)編碼基因占全基因長(zhǎng)度的比例高得多。于是，我們不禁發(fā)問：是否那98%的非編碼基因（non-coding RNA, ncRNA）造就了人體的復(fù)雜性？ncRNA是如何參與生命活動(dòng)的呢？

起初，人們對(duì)ncRNA的認(rèn)知有限，認(rèn)為ncRNA是junk?gene，可能只是避免外界不利環(huán)境，比如射線、病毒等破壞人類基因的“掩體”。隨著研究的深入，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)了ncRNA的重要性。ncRNA只是不編碼蛋白，但并非不被轉(zhuǎn)錄，事實(shí)上這些ncRNA也是不斷地被轉(zhuǎn)錄出來(lái)參與蛋白質(zhì)的合成過程。其中人們最熟悉的有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA，參與核糖體合成的rRNA和snoRNA。目前與腫瘤高度相關(guān)的主要有l(wèi)ncRNA, microRNA, circRNA這三類，它們?cè)诎┌Y的增殖、遷移、細(xì)胞死亡抵抗等方面均參與著重要作用。在臨床的癌癥檢查上，ncRNAs也已成為了一個(gè)重要的hallmark，為癌癥的提前篩查提供了很大的幫助。[1]-[4]

microRNA簡(jiǎn)稱miRNA，通過堿基配對(duì)原則與mRNA互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA被靶向切割，穩(wěn)定性下降，最終被降解。miRNA的作用原理雖然單一，但它依然能在癌癥發(fā)展的各個(gè)方面起到調(diào)節(jié)作用：若miRNA能與抑癌基因的mRNA結(jié)合，miRNA便能夠促進(jìn)腫瘤的存活和復(fù)制。相反，若結(jié)合到原癌基因的mRNA上，miRNA便能抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)增。

lncRNA的功能則較為多樣：①直接與mRNA結(jié)合抑制其翻譯，又或與蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄水平；②充當(dāng)miRNA海綿，特異性的結(jié)合到某種miRNA上，持續(xù)性的干擾miRNA的正常功能；③作為細(xì)胞內(nèi)復(fù)合體的骨架，使得蛋白和RNA穩(wěn)定地結(jié)合到一起。

circRNA本質(zhì)上也是lncRNA，這種長(zhǎng)鏈的非編碼RNA會(huì)在轉(zhuǎn)錄出來(lái)后會(huì)形成單鏈閉合環(huán)。其作用機(jī)制與IncRNA相似，能調(diào)節(jié)原癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，也能作為分子海綿競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA發(fā)揮作用。且有文獻(xiàn)提示其可充當(dāng)分子支架，為復(fù)合體提供結(jié)合場(chǎng)所。

ncRNA功能研究的方法及敲除策略

研究ncRNA的功能少不了要對(duì)其進(jìn)行基因編輯，RNAi技術(shù)在科研探索上是較為便捷常用的一種手段。但由于其效率低且有一定的脫靶概率，科研工作者開始尋求新的編輯手段。相比于RNAi技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)有著脫靶概率低、敲除更徹底、可干預(yù)RNAi難以干預(yù)的核內(nèi)RNA等優(yōu)勢(shì)，更適用于ncRNA的靶向干預(yù)及基因敲除。[5],[6]?以下是miRNA、lncRNA、circRNA的CRISPR/Cas9敲除策略：

miRNA片段較小，敲除相對(duì)而言較為簡(jiǎn)單。其靶序列可以設(shè)計(jì)在miRNA成熟體上、莖環(huán)處、或者設(shè)計(jì)一對(duì)gRNA直接將整個(gè)miRNA序列敲掉，但需要注意的是敲除區(qū)域不能與其他編碼基因重疊。

LncRNA比較長(zhǎng)，只敲除部分堿基難以對(duì)功能產(chǎn)生較大影響，故須盡可能地將全部序列敲除。一般采用大片段基因敲除策略，從上至下設(shè)計(jì)2-4條gRNA。

而circRNA經(jīng)常與編碼基因的外顯子重疊，故其敲除更為困難且復(fù)雜——敲除circRNA的同時(shí)要避免破壞外顯子。一般是敲除位于內(nèi)含子中的circRNA成環(huán)元件，這樣做即能破壞circRNA功能，又不會(huì)對(duì)編碼基因造成影響（圖3）。

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?在了解了ncRNA在腫瘤中的作用機(jī)制以及ncRNA敲除策略后，一起來(lái)欣賞幾個(gè)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ncRNA研究案例吧~

1、利用CRISPR/Cas9敲除miR-137分析腫瘤細(xì)胞的耐藥性機(jī)制

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Jiang團(tuán)隊(duì)在British Journal of Cancer?發(fā)表的microRNA-137 promotes apoptosis in ovarian cancer cells via the regulation of XIAP[7]一文中闡明了miR-137在順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡中起重要作用。[7]

目前可以確定的是順鉑能夠通過促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到治療的效果，但是其機(jī)制尚不清楚。為回答這一問題，Jiang團(tuán)隊(duì)通過雙熒光素酶報(bào)告基因，篩選出了8個(gè)miRNA能夠調(diào)控凋亡調(diào)節(jié)因子XIAP（哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最有效的凋亡調(diào)節(jié)因子），其中miR-137具有較高的顯著性，同時(shí)該miR-137的高表達(dá)在其他的腫瘤中也起重要的抑制作用，因此團(tuán)隊(duì)選擇miR-137進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。通過過表達(dá)miR-137,?卵巢癌細(xì)胞A2780下調(diào)了凋亡調(diào)節(jié)因子XIAP，使得卵巢癌細(xì)胞面對(duì)順鉑的誘導(dǎo)，更容易發(fā)生細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-137在卵巢癌細(xì)胞凋亡中的起著抑癌基因的作用，Jiang團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了三種sgRNA分別靶向成熟?miR-137 的上游、下游和精確區(qū)域，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性敲除了A2780細(xì)胞系中的miR-137，發(fā)現(xiàn)miR-137敲除后，XIAP隨之上調(diào)，并且細(xì)胞凋亡率降低。

2、利用CRISPR/Cas9敲除SNHG1分析腫瘤細(xì)胞增殖和集落形成能力的機(jī)制

國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)生物醫(yī)學(xué)電子與生物信息學(xué)研究所的Juan團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，SNHG1的高表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma, NB）的不良預(yù)后高度相關(guān)。于是Juan團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了兩條gRNA，使用CRISPR/Cas9?技術(shù)敲低了SK-N-BE(2)C細(xì)胞系（一種NB的細(xì)胞系）內(nèi)源性SNHG1。Juan團(tuán)隊(duì)在LncRNA SNHG1 regulates neuroblastoma cell fate via interactions with HDAC1/2[8]一文中提示，SNHG1的敲低抑制了NB細(xì)胞系的增殖。并且，通過對(duì)細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組的分析，提示SNHG1與多種生物過程息息相關(guān)，比如細(xì)胞的遷移，生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡抵抗。并且SNHG1能夠影響?核心調(diào)節(jié)環(huán)路（core regulatory circuitry，?CRC）成員基因的表達(dá)，CRC包括PHOX2B、HAND2、GATA3、ISL1、TBX1和MYCN。

Juan團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用ChIP-seq與ATAC-seq發(fā)現(xiàn)SNHG1和 HDAC1/2 之間可能存在相互作用，然后，通過pull-down和RIP進(jìn)一步證實(shí)了兩者的互作關(guān)系。

以上Juan團(tuán)隊(duì)解析了SNHG1在NB中的作用機(jī)制，并且提示，阻斷SNHG1與HDAC1/2 相互作用將會(huì)是抑制NB細(xì)胞增殖和形成集落的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，為治療NB的提供了潛在治療策略。

3、利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究肝細(xì)胞癌發(fā)展的信號(hào)通路

與正常肝組織相比，HCC 患者腫瘤組織中circSOD2處于高表達(dá)狀態(tài)。抑制circSOD2能夠顯著地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，減緩體內(nèi)成瘤的速度。溫州醫(yī)科大學(xué)Tu團(tuán)隊(duì)在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research發(fā)表的CircSOD2 induced epigenetic alteration drives?hepatocellular carcinoma progression through activating JAK2/STAT3 signaling pathway[9]提出了一條新的信號(hào)通路軸，為肝癌的預(yù)防和藥物干預(yù)提供了新的思路。

Tu團(tuán)隊(duì)通過RNA?相互作用組數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并利用Ago2?pull-down和biotin?pull-down技術(shù)，以及觀察沉默和過表達(dá)CircSOD2后miR-502-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CircSOD2在肝臟腫瘤細(xì)胞中充當(dāng)“miRNA海綿的作用“，特異性地結(jié)合到miR-502-5p上，有效地抑制了miR-502-5p的表達(dá)。

隨后，Tu團(tuán)隊(duì)有利用了上述類似的實(shí)驗(yàn)原理，發(fā)現(xiàn)加入miR-502-5p的類似物之后，一個(gè)在各種肝癌細(xì)胞系中均高表達(dá)的蛋白——DNMT3a發(fā)生了明顯表達(dá)下調(diào)。

團(tuán)隊(duì)為進(jìn)一步研究DNMT3a在HCC?中作用的分子機(jī)制，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建出DNMT3a-KO的HEPG2?和?HUH7?細(xì)胞系。從WB的結(jié)果看以看出，DNMT3a可能是通過SOCS3/JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)控HCC細(xì)胞增殖的。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步根據(jù)DNMT3a是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶這一線索，利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和CHIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了信號(hào)通路的可靠性。最終得出結(jié)論，即DNMT3a?上調(diào)促進(jìn)?SOCS3?啟動(dòng)子甲基化并抑制?SOCS3?表達(dá)，從而進(jìn)一步激活?JAK2/STAT3?信號(hào)通路。

許多ncRNA已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)胞中，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，遷移和逃避細(xì)胞死亡的作用。同時(shí)，另外一些ncRNA能夠發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂周期、激活程序性死亡、維持基因組穩(wěn)定性，直接或間接地抑制腫瘤的發(fā)生。

上述案例借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行ncRNA的功能研究都獲得理想效果，源井生物擁有200+常用細(xì)胞系基因編輯實(shí)驗(yàn)參數(shù)，效率高10倍的CRISPR-UTM專利技術(shù)，可提供lncRNA、miRNA、circRNA敲除細(xì)胞定制服務(wù)，優(yōu)質(zhì)純合交付快至4周！更有超3000種敲除細(xì)胞現(xiàn)貨1周達(dá)。歡迎復(fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/knockout.html?bilibilincRNA

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2?Renganathan, A. & Felley-Bosco, E. Long Noncoding RNAs in Cancer and Therapeutic Potential.?Adv Exp Med Biol?1008, 199-222, doi:10.1007/978-981-10-5203-3_7 (2017).

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7?Li, X.?et al.microRNA-137 promotes apoptosis in ovarian cancer cells via the regulation of XIAP.?Br J Cancer?116, 66-76, doi:10.1038/bjc.2016.379 (2017).

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9?Zhao, Z.?et al.CircSOD2 induced epigenetic alteration drives hepatocellular carcinoma progression through activating JAK2/STAT3 signaling pathway.?J Exp Clin Cancer Res?39, 259, doi:10.1186/s13046-020-01769-7 (2020).

原文：https://www.ubigene.com/literature/5245.html?bilibilincRNA