WB（Western Blot）：即蛋白質(zhì)免疫印跡，是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)，它結(jié)合了SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白的高分辨率及抗原抗體反應(yīng)的特異性。

WB的特點(diǎn)：

??????? 利用抗原抗體的特異性反應(yīng)完成檢測(cè)，結(jié)果更可靠；

??????? 可以做內(nèi)部參照（加入內(nèi)參），分析更方便；

??????? 可以分辨出相同分子量大小的目標(biāo)表蛋白；

典型的印記實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)步驟：

??????? 蛋白質(zhì)的電泳分離

??????? 電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域

??????? 免疫學(xué)檢測(cè)

WB ——常規(guī)樣品處理

常用裂解液類型

?? 貼壁/懸浮細(xì)胞

??????? 收集細(xì)胞

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，輕輕倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；

加2ml預(yù)冷的PBS，洗2次，去掉死細(xì)胞；

加入胰酶消化細(xì)胞；

加入完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀；（懸浮細(xì)胞直接離心收集細(xì)胞沉淀，不需要消化）

PBS漂洗，離心，重復(fù)兩遍，洗掉殘余培養(yǎng)基，棄倒殘余的PBS，只留細(xì)胞沉淀（可凍存于-80后一起提蛋白）

??????? 裂解

取上一步收集的細(xì)胞沉淀；

加入RIPA（強(qiáng)）裂解液，裂解液需要提前加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑（1：100）；

冰上裂解10—20min；

??????? 收集樣品

裂解好之后，4℃，高速離心，12000rpm/10min；

收集上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，整個(gè)過(guò)程需在冰上進(jìn)行；

分裝保存于-20℃或者-80℃中備用；

?? 腫瘤組織樣品

??????? 勻漿機(jī)（上海凈信全自動(dòng)樣品快速研磨儀）

取小鼠腫瘤組織，純水沖洗，吸水紙吸掉多余水分；

剪刀剪取30mg組織樣品；每管加入300ul RIPA強(qiáng)裂解液，加入3ul蛋白酶抑制劑（1：100的比例加入），加入2顆鋼珠；

勻漿儀勻漿，65HZ，30s，勻漿2次后，冰上裂解30min；

棄掉鋼珠，4℃，12000rpm/10min高速離心；

收集上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，整個(gè)過(guò)程需在冰上進(jìn)行；

分裝保存于-20℃或者-80℃中備用；

??????? 超聲破碎儀

取小鼠腫瘤組織，純水沖洗，吸水紙吸掉多余水分；

剪刀剪取30mg組織樣品；每管加入300ul RIPA強(qiáng)裂解液，加入3ul蛋白酶抑制劑（1：100的比例加入）；

超聲破碎儀破碎，10-15s，超聲頻率是30%-40%，重復(fù)3次（期間每次間隔10s），冰上裂解10-30min；（樣品之間，探頭需要沖洗）

4℃，12000rpm/10min高速離心；

收集上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，整個(gè)過(guò)程需在冰上進(jìn)行；

分裝保存于-20℃或者-80℃中備用；

WB —— 蛋白定量

常用的蛋白定量方法對(duì)比

提取的樣品中若含有去垢劑則需要選用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，若樣品中含有螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類等，則需要選用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

??????? BCA法蛋白定量（雅酶試劑盒，ZJ101，實(shí)驗(yàn)室在用的）

取試劑盒中最大濃度8號(hào)，以PBS進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，稀釋6個(gè)點(diǎn)（第一孔為標(biāo)準(zhǔn)品原液，10ul標(biāo)準(zhǔn)品+10ulPBS稀釋），最后一個(gè)點(diǎn)為PBS陰性對(duì)照，加入到96孔板中；

蛋白樣品按照10倍稀釋，取2ul蛋白樣品+18ulPBS，加入到96孔板中；

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制顯色液，充分混勻，每孔加顯色液200ul；

37度孵育30min；

酶標(biāo)儀562nm檢測(cè)OD值；

蛋白樣品濃度歸一化（有模板，有需要私信或評(píng)論）

WB —— 蛋白變性（加熱）

金屬浴95°C-100°C，加熱5-10min，加熱使樣品變性（若加熱10min仍然粘稠可適當(dāng)補(bǔ)加SDS-Loading buffer；煮蛋白時(shí)間不能太長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生蛋白交聯(lián)或降解）；

煮沸變性后的蛋白應(yīng)立刻置于冰上降溫，防止蛋白聚集復(fù)性；

膜蛋白，多重跨膜蛋白的變性：70℃ 加熱10分鐘（煮沸可能會(huì)使膜蛋白發(fā)生聚合）；

樣品短期可保存在-20°C，長(zhǎng)期保存在-80°C；

WB —— SDS-PAGE電泳

上樣規(guī)格：0.1mm/15孔梳子，上樣10ul，總量15ug;

SDS-PAGE（自己配制，碧云天的試劑盒，P0012A）：上樣前可用針管吹一吹，避免氣泡和多余凝膠堵塞上樣孔，以免樣品溢出到電泳緩沖液中；

上樣前蛋白處理：上樣的蛋白樣品95-100℃加熱5min，12000rpm離心5min（凍存樣品會(huì)有SDS沉淀析出，影響跑膠結(jié)果），吸取上清上樣；一般1mm/15孔的梳子，上樣10ul；為了區(qū)分加樣的順序，marker可一邊加5ul，一邊加2-3ul；

SDS-PAGE Running Buffer：一般是買(mǎi)的10X的成品buffer，純水稀釋至1X后使用；

SDS-PAGE電泳條件：一般以小電壓80-100V起跑，10-15min，樣品會(huì)跑到一條平齊的線上，marker可看到條帶時(shí)（即樣品跑入分離膠中），再加大電壓換120V/50-60min；

WB —— SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜緩沖液的配制（現(xiàn)配現(xiàn)用，電泳跑到分離膠就可以配制了）：

1L體系：3.03g的Tris；14.4g的甘氨酸；200mL甲醇；純水定容至1L，充分?jǐn)嚢杈鶆颍湃胫票鶛C(jī)或者-20℃提前預(yù)冷；

轉(zhuǎn)膜條件：濕轉(zhuǎn)，200V/90min，若蛋白過(guò)大，可適當(dāng)延長(zhǎng)；

實(shí)驗(yàn)步驟：

換用干凈手套，取PVDF膜，并剪至合適大小，放于甲醇中浸泡數(shù)十秒（甲醇可活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更易跟帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合）

將提前預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液倒入盤(pán)中；

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜三明治夾，海綿，濾紙，浸濕備用；

取出電泳完的玻璃板，撬去玻板（動(dòng)作要輕，上下都需要撬），切掉上下多余的部分，借助轉(zhuǎn)膜緩沖液輕輕松動(dòng)凝膠，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用；

平放轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移槽，依次在黑色面疊放海綿，3張浸泡過(guò)的濾紙（按照濾紙的厚度進(jìn)行增減），凝膠，PVDF膜（為了區(qū)分，可減角進(jìn)行標(biāo)識(shí)），每疊放一層，都需要趕走氣泡，紅面上疊放海綿，3張浸泡過(guò)的濾紙；

夾緊后，放入轉(zhuǎn)膜槽，黑板對(duì)黑板；

轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)兩側(cè)可放冰袋，外側(cè)可用冰水混合物+冰袋包圍，降低溫度（轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，會(huì)發(fā)熱，避免膜被燒干）

設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件，200V/90min；

WB —— 封閉

試劑配制（轉(zhuǎn)膜開(kāi)始之后就可以配）

1XPBST（0.02%）：1L PBS+2mL Tween 20，充分混勻后室溫存放；

5%的脫脂奶粉（現(xiàn)配現(xiàn)用）：稱量2.5g脫脂奶粉到1XPBST中，充分渦旋混勻，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

封閉：取出轉(zhuǎn)膜成功的PVDF膜，放置于5%脫脂奶粉中，室溫?fù)u床封閉1h；

（封閉的作用：用大分子物質(zhì)封閉非相關(guān)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，降低抗體與膜的特異性吸附，降低背景，Tween 20的作用也是減少非特異性吸附）

WB —— 一抗孵育

封閉完成后，即可開(kāi)始孵一抗；

參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例稀釋一抗，一般1：1000稀釋，用含5%脫脂牛奶的PBST進(jìn)行配制（注意樣品和抗體的種屬需要匹配）；

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需要檢測(cè)的蛋白大小，將膜進(jìn)行切割（可將膜放入PE手套，加一點(diǎn)封閉液，用尺子比著marker，用切膠的小刀切膜），并將膜的一角切除或者標(biāo)記筆標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分；

將稀釋好的一抗加入到孵育的盒子里，放入對(duì)應(yīng)切好的條帶，4度搖床過(guò)夜孵育；

內(nèi)參根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇，一般是β-actin，GAPDH抗體，1：10000進(jìn)行稀釋，具體的參照實(shí)驗(yàn)室買(mǎi)的抗體的說(shuō)明書(shū)；

孵育完的一抗可進(jìn)行回收，一般可重復(fù)利用5-10次；

WB —— 二抗孵育

回收一抗；

將孵育過(guò)一抗的膜夾到洗膜的容器里（我們實(shí)驗(yàn)室常用的是96孔板的殼子），加入1X PBST，一般洗3次，每次5min（如果有實(shí)驗(yàn)耽擱，洗久一點(diǎn)也沒(méi)關(guān)系）；

用1X PBST配制二抗，參照說(shuō)明書(shū)，注意種屬，一般是1：10000稀釋，室溫下?lián)u床孵育1h;

將孵育過(guò)二抗的膜夾到洗膜的容器里（我們實(shí)驗(yàn)室常用的是96孔板的殼子），加入1X PBST，一般洗3次，每次5min（如果有實(shí)驗(yàn)耽擱，洗久一點(diǎn)也沒(méi)關(guān)系）；

WB —— 化學(xué)發(fā)光

在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪一張PE手套，將PVDF膜放在PE手套上；

將ECL的A液和B液在EP管內(nèi)等體積混合，均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)2-5min；

在照膠儀內(nèi)鋪一張PE手套；

取孵育好的PVDF膜，吸干多余的ECL工作液，將膜放到PE手套上；

照膠儀曝片，保存，數(shù)據(jù)分析；