蜜蜂在出生時候都一樣，但是吃食蜂王漿的最后變成了蜂王，沒有吃食則成了工蜂；同卵雙胞胎基因組相同，但依然會顯示出肉眼可見的差異；睡眠不足會導(dǎo)致人類基因組中DNA甲基化的水平產(chǎn)生變化， 這種表觀遺傳的印記還可能傳遞給我們的后代。這些現(xiàn)象都是如何解釋呢？

我們都知道通過中心法則，有的基因可以表達有的基因表達則不表達，而表觀遺傳可能決定著這些基因的表達方式表達時間等。?表觀遺傳學可以定義為研究基因表達的可遺傳變化，這種變化獨立于原始DNA序列的變化，會受環(huán)境等因素的影響而發(fā)生改變?；虮磉_的表觀遺傳調(diào)控是由DNA甲基化、組蛋白修飾等機制介導(dǎo)。?

DNA甲基化是哺乳動物中研究最深入的表觀遺傳修飾之一。1983年，F(xiàn)einberg 與Vogelstein發(fā)現(xiàn)腸癌組織中特定基因的甲基化水平降低，同年，Gama-Sosa等人證實腫瘤樣品中5-甲基胞嘧啶的減少，自此科學界開始廣泛研究甲基化與癌癥的關(guān)系，并取得了很多突破性的進展。

在正常細胞中，DNA甲基化擁有調(diào)節(jié)基因表達和沉默的重要作用。動物基因組中，甲基化主要發(fā)生在CG位點上，是一種共價修飾方式，DNA復(fù)制后，硫-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosylmethionine）通過酶反應(yīng)把-CH3基團添加到基因組胞嘧啶上。哺乳動物中，基因組中約60%-90%的CpG核酸位點DNA甲基化，在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾堿基，通常情況，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島,位于結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點，人類大約有 30 億個堿基對，基因組中大約有 2800 萬個 CpG 位點。?

通過以上對DNA甲基化的表述不難看出DNA修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，因此這一機制的缺陷可能導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病也就不足為奇了。在癌癥發(fā)生時，抑癌基因啟動子區(qū)域表現(xiàn)為高甲基化，基因啟動子甲基化以后基因表達就會減弱甚至關(guān)閉。惡性腫瘤中大多數(shù)基因的開關(guān)由DNA甲基化調(diào)控，幾乎所有腫瘤發(fā)生時都會伴隨DNA甲基化的異常發(fā)生，通常情況下高甲基化與低甲基化并存。如腫瘤細胞中抑癌基因啟動子通常為高甲基化，抑制抑癌基因表達使其喪失抑癌功能，從而促進癌癥的發(fā)生。而低甲基化則通常是整個基因組低甲基化或原癌基因啟動子的低甲基化，前者染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致癌變發(fā)生，后者則激活原癌基因，誘導(dǎo)細胞癌變。在腫瘤細胞中，基因組整體甲基化水平降低至 20~50%，與正常細胞相比，約有 10~60% 的 CpG 位點甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變。????

全世界范圍內(nèi)，前五名的癌癥是乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌，前列腺癌，胃癌，而最引人注目的一點莫過于乳腺癌!在所有癌癥發(fā)病占比中，乳腺癌首次超越肺癌站上了冠軍的位置。

早在2018年的統(tǒng)計報告中，癌癥所致死亡在中國還屈居第二，而來到2020年，中國人的死亡原因排名中癌癥已經(jīng)躍居第一。

隨著人類對抗癌癥的嚴峻形勢，腫瘤早篩的市場應(yīng)運而生，甲基化幾乎發(fā)生在所有的腫瘤當中，所以針對于不同腫瘤靶點的甲基化試劑盒受到了廣泛關(guān)注，其中腸癌因其具有明確的早篩臨床意義，以及相對成熟的技術(shù)路徑，相對其他癌種的早篩產(chǎn)品走的更快，也為降低腸癌的死亡率做出了很重要的貢獻。

2014年，Exact Sciences結(jié)合多學科原理，建立了多靶點糞便DNA檢測方法，推出了Cologuard，用于腸癌篩查并獲得了FDA審批。包括7個DNA點突變位點（KRAS），以及2個DNA甲基化位點（NDRG4和BMP3）2017年以來，我國也有近十個甲基化試劑盒面向市面，涵蓋腸癌、胃癌等癌種，腸癌的早篩試劑盒因其檢測樣本獲取簡單，樣本無需復(fù)雜處理，操作便利，準確快速，無侵入創(chuàng)傷性，成為早期結(jié)直腸癌很有前景的篩查方法之一。小編搜索數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，目前在注冊階段的甲基化試劑盒有幾十個。2021年，北京市率先將甲基化檢測納入醫(yī)保范疇，足見甲基化試劑盒的研發(fā)前景廣闊。DNA甲基化標記物被認為是一種預(yù)測因素。它們不僅可用于早期疾病的篩查，還可用于確定個體對化療的反應(yīng)。此外，在治療或治療性手術(shù)后監(jiān)測DNA甲基化譜可能可以給治療有效性的評估和檢測疾病復(fù)發(fā)提供證據(jù)。

基于此，甲基化試劑盒的研發(fā)已經(jīng)成為各大IVD企業(yè)爭相開發(fā)的模塊，而在甲基化研發(fā)階段，獲得穩(wěn)定的陽性和陰性對照至關(guān)重要，早期使用體外構(gòu)建質(zhì)?；騺喠蛩猁}轉(zhuǎn)化的 DNA作為企業(yè)參考品已經(jīng)逐漸退出甲基化試劑盒研發(fā)的舞臺，若使用來自臨床的樣本作為對照又受限于該標準品的不穩(wěn)定和難獲取的特性。所以尋找穩(wěn)定的甲基化/非甲基化細胞株以及構(gòu)建去甲基化/甲基化細胞株成為企業(yè)較為傾向的對照品，來源于細胞株的對照品可以實現(xiàn)穩(wěn)定的供應(yīng)，且成本較低。

說到基因編輯細胞，CRISPR技術(shù)在基因編輯細胞的工作中大放異彩，不僅有Cas9對基因的特定編輯，Cas9的核酸酶發(fā)生雙突變后可以產(chǎn)生“鈍化”和“死亡”Cas9，即“dCas9”，這種核酸酶失去切割DNA的功能，但在gRNA的指導(dǎo)下仍能以相同的精確度靶向和結(jié)合DNA。切割失活的Cas9連上轉(zhuǎn)錄抑制和激活元件，可以達到基因組特定位點的修飾， dCas9蛋白可以與效應(yīng)器阻遏（如蛋白和激活劑結(jié)構(gòu)域）形成融合蛋白，這樣，dCas9可以將這些效應(yīng)器帶到啟動子區(qū)域、調(diào)控區(qū)域或編碼區(qū)域，對任何基因進行精確定點調(diào)控而不造成DNA損傷, 如結(jié)合TET1（DNA甲基化羥化酶）可以特異性催化DNA的去甲基化，從而調(diào)節(jié)基因的表達.

海星生物利用CRISPR技術(shù)可以對特定基因的甲基化進行編輯，此外也可以構(gòu)建去甲基化的廣泛使用細胞株，海星生物也致力于建立細胞平臺，整合甲基化細胞株，助力甲基化試劑盒研發(fā)。?

參考文獻：Kulis M, Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet. 2010;70:27-56. doi: 10.1016/B978-0-12-380866-0.60002-2. PMID: 20920744.

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 干細胞/原代細胞 培養(yǎng)試劑盒?